芹菜素對糖尿病大鼠腎功能的保護作用及機制研究

奚 丹，蘇 卿

（1.長春醫學高等?？茖W校，吉林 長春 130000； 2.大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧 大連 116000）

國際糖尿病聯盟2020 年的數據表明，全球共有4.63億糖尿病患者，在成年人群中的發病率為9.3%，預計到2040 年發病人數將會突破6.42 億［1］。糖尿病腎病為糖尿病最嚴重的并發癥之一，是導致糖尿病患者殘疾及死亡的首要原因，因而進行早期預防極為重要［2］。目前，臨床上控制高血壓和降低血糖是預防及治療糖尿病腎病的主要手段，但存在用藥局限及諸多不良反應，效果難以令人滿意［3］。炎癥反應和氧化應激在糖尿病腎病的發生及進展中發揮重要作用，抑制炎癥反應及氧化應激是延緩該病進展的有效方法［4］。中藥應用歷史悠久，具有多靶點、多途徑的優勢，在降低肌酐值、尿蛋白量及改善腎功能等方面均具有較大的優勢，日益受到研究者的關注［5］。

芹菜素為黃酮類化合物，主要以植物黃色素的形式廣泛存在于多種蔬菜、中藥材及水果中［6］，具有抗炎、抗氧化應激、抗動脈粥樣硬化、調節免疫及抗腫瘤等多種藥理作用［7］。有研究發現，芹菜素可顯著降低高脂喂養聯合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的2 型糖尿病大鼠及四氧嘧啶聯合STZ 誘導的1 型糖尿病大鼠的血糖水平［8-10］。然而，關于芹菜素對糖尿病大鼠腎功能的保護作用及其分子機制并未闡明。本研究通過高脂飼料聯合STZ 法建立糖尿病大鼠模型，給予芹菜素干預，探討其對腎功能的保護作用，并從炎癥反應及氧化應激的角度闡述分子機制，為芹菜素應用于糖尿病早期腎損傷的防治提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD 大鼠，體質量（200±20）g，購自上海杰思捷實驗動物公司，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2018-0004。

1.2 試劑與藥物 芹菜素（湖南賽禾生物科技有限公司，純度＞90%，批號180419），用0.5% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成混懸液。厄貝沙坦片（美國威斯敏斯特公司，規格75 mg／片，批號69367-119-01）；STZ（美國Sigma 公 司，批號046K1206）；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒（北京華英生物技術研究所，批號20190320、20190325）；白細胞介素2（IL-2）、IL-6、C 反應蛋白（CRP）檢測試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司，批號18070601、18091101、18112501）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（上海酶研生物科技有限公司，批號20190118、20190328、20181225）；核因子κB p65（NF-κB p65）、NFκB 抑制蛋白α（IκBα）、核因子E2 相關因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）、甘油醛3 磷酸脫氫酶（GAPDH）抗 體（英 國 Abcam 公 司，批號 ab207297、ab109300、ab137550、ab189491、ab8245）。

1.3 儀器 BSA2235 型分析天平（德國Sartorius 公司）；KDC-160R 型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；卓越型血糖儀（瑞士羅氏公司）；Chemray 240型全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；LKB-1 型超薄切片機（德國Leica 公司）；YKT-2800 型顯微鏡（上海永科光學儀器公司）；Epoch 型酶標儀（美國BioTek 公司）；X6 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；MiniTrans-blot 型電轉印槽及165-8001 型垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 采用高糖高脂飼料喂養聯合腹腔注射STZ 方法建立糖尿病大鼠模型［11］。大鼠經高糖高脂飼料喂養4 周后劑量腹腔注射30 mg／kg STZ 溶液，3 d 后測定空腹血糖（FBG），FBG≥11.1 mmol／L 者視為造模成功，FBG＜11.1 mmol／L 者排除。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦組（15 mg／kg）及芹菜素低、高劑量組（50、100 mg／kg），每組10 只，另取10 只健康大鼠（標準飼料喂養）作為正常組，灌胃給予相應藥物，每天1 次，給藥4 周，其中模型組和正常組大鼠灌胃等體積0.5%CMC-Na 溶液。末次給藥結束，稱定各組大鼠體質量，并用代謝籠收集24 h 尿液；隨后腹腔注射20%烏拉坦進行麻醉，腹主動脈取血，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min，分離得血清，分裝后備用；頸椎脫位法處死大鼠，分離腎臟組織，稱定質量后備用。

2.2 FBG、24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數檢測采用血糖儀測各組大鼠FBG 水平；通過雙縮脲法采用全自動生化分析儀檢測24 h 尿蛋白量；通過酶法采用全自動生化分析儀檢測Scr、BUN 水平；腎肥大指數＝雙腎質量／體質量。

2.3 HE 染色觀察腎組織病理改變 使用4% 多聚甲醛固定腎臟組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片，經脫蠟、水洗及蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織病理改變情況。

2.4 腎組織炎癥反應和氧化應激指標檢測 取各組大鼠部分腎臟組織，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液進行充分裂解，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，分離得上清液，分裝后凍存備用。參照說明書中操作步驟，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法分別檢測腎組織炎癥反應指標IL-2、IL-6、CRP 水平，氧化應激指標SOD、CAT 活性及MDA 水平。

2.5 Western blot 法檢測腎組織NF-κB p65、IκBα、Nrf2、HO-1 蛋白表達 取“2.4” 項下腎組織勻漿上清液，二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度，經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉及一抗、二抗孵育后，采用化學發光法進行顯色、曝光及顯影。圖片掃描后，用Image J 軟件進行灰度值分析，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白相對表達量。

2.6 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 芹菜素對糖尿病大鼠體質量及FBG 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠體質量降低（P＜0.01），FBG 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組大鼠體質量增加（P＜0.01），FBG 水平降低（P＜0.01），而陽性藥厄貝沙坦組大鼠體質量、FBG 水平均無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 芹菜素對糖尿病大鼠體質量及FBG 水平的影響（±s， n＝10）

表1 芹菜素對糖尿病大鼠體質量及FBG 水平的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 芹菜素對糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數的影響 與正常組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數均升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 芹菜素對糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數的影響（±s， n＝10）

表2 芹菜素對糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織病理改變的影響 正常組大鼠腎組織未見系膜細胞增生，細胞排列緊密、胞漿豐富，腎小管間質區域結構清晰，腎小球體積正常；模型組大鼠腎組織系膜基質增多，腎小管可見炎性浸潤、空泡及腫脹，腎小球體積增大；芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織系膜基質稍有增多，腎小管炎性浸潤、空泡及腫脹等病理改變程度均有不同程度的緩解，腎小球體積增大趨勢也低于模型組，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理改變情況（HE 染色，×200）

3.4 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織炎癥反應的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織IL-2、IL-6 及CRP 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織IL-2、IL-6 及CRP 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示芹菜素具有抑制糖尿病大鼠腎組織炎癥反應的作用，見表3。

表3 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織炎癥反應的影響（±s， n＝10）

表3 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織炎癥反應的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織NF-κB p65蛋白表達升高（P＜0.01），而IκBα 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織NF-κB p65 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），而IκBα 蛋白表達升高（P＜0.01），提示芹菜素抑制腎組織炎癥反應與調控NF-κB 信號通路有關，見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白條帶圖

表4 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達的影響（±s， n＝10）

表4 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織氧化應激的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織SOD、CAT 活性降低（P＜0.01），而MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織SOD、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），而MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示芹菜素具有減輕糖尿病大鼠腎組織氧化應激的作用，見表5。

表5 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s， n＝10）

表5 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達均降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達均升高（P＜0.01），提示芹菜素減輕腎組織氧化應激的作用與調控Nrf2／HO-1 信號通路有關，見圖3、表6。

表6 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響（±s， n＝10）

表6 芹菜素對糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響（±s， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖3 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白電泳圖

4 討論

糖尿病腎病發病機制復雜，長期的高糖環境可以激活腎臟組織中的炎癥反應，一方面能刺激細胞外基質聚集，增厚基底膜并逐步出現腎小球硬化；另一方面也能對腎小球內皮細胞造成直接損害［12］。IL-2、IL-6 及CRP 均為常見的炎性細胞因子，參與了糖尿病腎病的病情進展并直接與蛋白尿水平呈正相關［13］。研究發現，芹菜素可以有效降低游離脂肪酸誘導的L02 細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-8 等炎性因子的表達，抑制炎癥反應［14］。本研究同樣發現，芹菜素能夠降低糖尿病大鼠腎組織IL-2、IL-6、CRP 水平，具有抑制糖尿病大鼠腎組織炎癥反應的作用。NF-κB信號通路在炎癥反應中起關鍵作用，可以介導IL-2、IL-6、CRP 等多種炎癥因子的轉錄和表達［15］。研究發現，給予動脈粥樣硬化模型大鼠芹菜素治療后，NF-κB p65 蛋白表達降低，表明芹菜素改善大鼠動脈粥樣硬化的作用與調控NFκB 信號通路有關［16］。本研究同樣發現，經芹菜素治療后，糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65 蛋白表達降低，而IκBα 蛋白表達增加，表明調控NF-κB 信號通路進而抑制炎癥反應是芹菜素保護糖尿病大鼠腎功能作用的潛在機制。

腎臟是氧化應激最敏感的器官之一，氧化應激是糖尿病腎損傷發生的重要環節，也是糖尿病腎病的誘發因素［17］。長期的高血糖環境可導致抗氧化酶的糖基化，使SOD、CAT 等抗氧化酶活性降低，減弱抗氧化系統清除能力；同時，持續的高血糖也能誘導機體產生MDA 等過氧化物產物，損傷腎臟，并逐漸發展為糖尿病腎?。?8］。本研究發現，芹菜素能夠增加糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT 活性，降低MDA 水平，具有減輕糖尿病大鼠腎組織氧化應激的作用。Nrf2 是具有調控抗氧化應激活性的轉錄因子，在正常生理狀態下，胞質內的胞質接頭蛋白Keap1 與Nrf2 形成復合物，使Nrf2 的活性被抑制；在氧化應激狀態下，Keap1與Nrf2 復合物解離，Nrf2 游離后進入細胞核，與抗氧化反應元件（ARE）結合，激活抗氧化酶基因HO-1 的表達，進而增強細胞的抗氧化能力［19］。楊麗等［20］研究發現，芹菜素可以升高妊娠期糖尿病大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達。本研究結果同樣證實，經芹菜素治療后，糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達升高，表明調控Nrf2／HO-1 信號通路進而減輕氧化應激水平是芹菜素保護糖尿病大鼠腎功能作用的又一個潛在機制。

綜上所述，本研究發現芹菜素能夠降低糖尿病大鼠FBG 水平、24 h 尿蛋白、Scr、BUN 及腎肥大指數，且能有效緩解腎組織病理性改變，證實其具有保護糖尿病大鼠腎功能的作用；進一步機制研究表明，該作用與抑制炎癥反應及氧化應激有關，但深入機制還有待于進一步的研究。