枳實生品及麩炒品對脾虛大鼠肝組織物質能量代謝酶活性及CaMK Ⅱ通路CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達的比較研究

林桂梅 來有雪 高慧 鞠成國 單國順

基金項目：

國家自然科學基金資助項目（編號：81503248）；遼寧省自然科學基金項目（編號：2019-MS-230）；遼寧省教育廳面上項目（編號：LJKMZ20221314）。

作者簡介：林桂梅（1982—），女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥炮制機理。E-mail： linguimei1982@163.com

通信作者：

【摘? 要】

目的：觀察枳實生品及麩炒品提取液對脾虛大鼠肝組織能量代謝相關酶活性及對CaMK Ⅱ通路CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達水平的影響。方法：SD大鼠隨機分為7組，空白對照組，利血平模型組，陽性藥組，枳實生品高、低劑量組及枳實麩炒品高、低劑量組。除空白對照組外，其余各組均采用利血平注射制成脾虛模型。測定各組大鼠肝勻漿中物質能量代謝相關指標的活性差異，采用蛋白免疫印跡法比較研究肝組織中CaM、CaMK Ⅱ及p-CaMK Ⅱ蛋白表達差異。結果：與模型組比較，枳實麩炒品高劑量組鈉鉀ATP酶（Na+-K+-ATPase）活性升高；枳實麩炒品高、低劑量組鈣鎂ATP酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）活性升高；枳實麩炒品高劑量組檸檬酸合成酶（CS）及異檸檬酸脫氫酶（ICD）均升高；枳實生品低劑量組CaM蛋白表達量升高；枳實麩炒品高劑量組CaMK Ⅱ表達量升高；枳實生制品高、低劑量組p-CaMK Ⅱ蛋白表達量均升高。結論：枳實麩炒品不論在三磷酸腺苷酶活性或是CaMK II信號通路關鍵分子蛋白表達方面均較生品有顯著提高，說明麩炒品能更好改善脾虛大鼠癥狀。

【關鍵詞】? 枳實；鈣調蛋白；肝組織；脾氣虛證

【中圖分類號】R285.5??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）24-0008-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324003

Effect of Raw and Stir-frying with Bran Aurantii Fructus Immaturus on the Metabolism of Substance and

Energy and Expression of CaM and CaMK II Protein in CaMK II Signaling Pathways in the

Liver Tissue of Rats with Spleen Deficiency Syndrome

LIN Guimei1，2? LAI Youxue3? GAO Hui1，2? JU Chengguo1，2? SHAN Guoshun1，2

1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600， China；

2. Traditional Chinese Medicine Processing Technology Inheritance Base （Liaoning） of the

State Administration of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China；

3.Dalian Sixth Peoples Hospital， Dalian 116600， China

Abstract：

Objective? To investigate the effect of raw and stir -frying with bran Aurantii Fructus Immaturus on the energy metabolizing enzyme activity and expression of CaM and CaMK II protein in CaMK II signaling pathways in the liver tissue of rats with spleen deficiency syndrome.

Methods SD rats were randomly divided into 7 groups：normal control group，Reserpine model group，Positive medicine group，Aurantii Fructus Immaturus raw and bran fried high and low dose groups. The spleen deficiency syndrome rat models were generated by reserpine injection，and ATPase activity were evaluated.Western blotting was used to test CaM，CaMK II，p-CaMK II expression in liver tissue of the spleen deficiency syndrome rats. Results Compared with the model group，he activity of Na+-K+-ATPase was increased in the high-dose of stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus，the activity of Ca2+-Mg2+-ATPase was increased in the high and low dose of stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus. the expression of CS and ICD increased in high-dose of stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus. The expression of CaM protein was increased in low dose of raw Aurantii Fructus Immaturus，the expression of CaMK Ⅱ increased in high-dose of stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus， the expression of p-CaMK Ⅱ increased in high-dose of raw and stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus. Conclusion The stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus could significantly improve the activity of adenosine triphosphatase and the expression of key molecular proteins in CaMK II signaling pathway.It shows that stir-frying with bran Aurantii Fructus Immaturus can better improve the symptoms of deficiency syndrome rats.

Keywords：

Aurantii Fructus Immaturus；CaM；CaMK II；p-CaMK II；Liver；Spleen deficiency syndrome

枳實為臨床常用的胃腸氣分藥，具有破氣消積，化痰散痞的作用，在臨床上治療胃腸疾病的經驗由來已久。但枳實生品的破氣作用較強，有損傷正氣之慮，因此常采用麩炒的炮制方法，緩和其峻烈之性［1-2］。中醫認為脾胃為后天之本，為氣血生化之源，能夠為機體組織提供營養和能量，嚴重脾虛則會導致各種生理功能障礙［3］。肝臟作為人體最大的代謝器官，與消化、吸收密切相關［4］。因此實驗通過脾虛動物實驗模型，選取與物質、能量代謝密切相關的肝臟組織中的ATP酶與三羧酸循環相關的CS、ICD和鈣調蛋白為研究對象［5-6］，比較研究枳實生品與麩炒品對脾虛大鼠肝組織物質能量代謝相關酶及CaM、p-CaMK、CaMK Ⅱ蛋白表達差異，進而從能量代謝角度研究枳實麩炒的炮制機理。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? Multiskan MK3酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；TDK-2水平脫色搖床（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DG-300C電泳儀（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；DYCZ-40D型迷你轉印電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2? 材料? 鈣鎂ATP酶試劑盒（Ca2+-Mg2+-ATPase，批號：20160625，南京建成生物工程研究所）；鈉鉀ATP酶試劑盒（Na+-K+-ATPase，批號：20160617，南京建成生物工程研究所）；檸檬酸合成酶試劑盒（CS，批號： 20160719， 南京建成生物工程研究所）；異檸檬酸脫氫酶試劑盒（ICD，批號： 20160721， 南京建成生物工程研究所）；利血平注射液（批號：1003011，天津金耀氨基酸有限公司）；四君子湯（京都念慈菴總廠有限公司，批號HKNT-12633）；苯甲基磺酰氟（PMSF）（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），二硫蘇糖醇（DTT）、Anti-CaM antibody、Anti-CaMK Ⅱ antibody、p-CaMK Ⅱ antibody，購自美國sigma公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）購自wako公司；DMEM培養基，標準胎牛血清（FBS）和青鏈霉素溶液購自Gibco公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自河北博海生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒，蛋白分子量Marker，加強型ECL檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發展有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；4×Tris·/SDS配置：300 mL水中溶解91 gTris堿，用1 mol/L鹽酸調節至pH為8.8，加水至500 mL，用0.45 μm濾膜濾過。加入2 gSDS，30%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺溶液：100 mL體積中丙烯酰胺30 g，雙丙烯酰胺0.8 g；凝膠緩沖液：用300 mL水溶解90.8 gTris堿，用6 mol/L鹽酸調節至pH8.6，加水至500 mL。枳實購自江西新干，經本校中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果。

1.3? 實驗動物? SD大鼠，雌雄兼用，體質量180～220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，適應性飼養7 d。

2? 方法

2.1? 枳實、麩炒枳實提取液制備? 稱取枳實、麩炒枳實各100 g，粉碎至粗粉，置燒杯中加入大約6倍體積蒸餾水，煎煮3次，每次30min，提取液合并過濾，濃縮水提液（相當于生藥1 g/mL），給藥時分高、低劑量組，分別為1 g/mL，0.25 g/mL。

2.2? 枳實生品及麩炒品提取液對利血平致脾虛大鼠肝組織三磷酸腺苷酶活性影響? 70只小鼠隨機分為7組：枳實生品高、低劑量組（1 g/mL，0.25 g/mL），麩炒枳實高、低劑量組（1 g/mL，0.25 g/mL），空白對照組，四君子湯陽性藥組（0.5 mg/kg）和利血平模型組（0.5 mg/kg），每組10只，除利血平模型組外均按0.7 mL/100 g體重劑量灌胃給藥，空白對照組給予等體積的生理鹽水。除空白對照組外各給藥組在給藥同時皮下注射利血平，注射用量為0.50 mg/kg，每天給藥1次，連續10 d，末次給藥前禁食不禁水24 h。大鼠處死，低溫條件下快速取肝組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，準確稱重后置于勻漿器中用9倍生理鹽水勻漿（勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中），制成1%的肝組織勻漿液，離心機 3500 r/min 離心 10min，取上清液，考馬斯亮藍法蛋白定量，其余上清液置4℃冰箱保存備用，Ca2+-Mg2+-ATPase和 Na+-K+-ATPase活性測定按照試劑盒操作步驟進行［7］。

ATPase活力計算公式如下［8］：

ATPase活力=測定OD值-對照OD值標準OD值

×標準品濃度（1 μmoL/mL）×反應體系中樣本稀釋倍數×6

÷待測樣本蛋白濃度（mg prot/mL）

2.3? 枳實生品及麩炒品提取液不同劑量組對利血平致脾虛大鼠肝組織三羧酸相關代謝酶影響? 按2.2項下方法，取肝臟迅速放入液氮中速凍，制成10%的肝組織勻漿液，酶聯免疫法測定試劑盒。

2.4? 枳實生品及麩炒品提取液不同劑量組對利血平致脾虛大鼠肝組織CaM、CaMK Ⅱ、p-CaMK Ⅱ蛋白表達影響? 大鼠處死后，迅速取出肝組織，放入預冷裂解液中裂解組織蛋白，選用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定。取等量蛋白樣品（30 μg/樣品），加入上樣緩沖液，97℃加熱6min變性，待冷卻至室溫后，離心上樣，進行SDS-PAGE電泳，采用電轉儀進行轉模，5%脫脂奶粉封閉30min后，加入一抗（用封閉液稀釋），室溫孵育1 h，1×TBST漂洗3次，時間依次為15min、5min、5min。加入適當比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗3次，時間依次為15min、5min、5min?；瘜W發光底物進行化學發光，暗室顯影后，使用Quantity one軟件對其進行光密度分析［9］。

2.5? 統計學分析? 實驗采用SPSS 13.0統計軟件處理，結果以均數加減標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3? 結果

3.1? 枳實生品及麩炒品提取液對利血平致脾虛大鼠肝組織三磷酸腺苷酶活性影響? Na+-K+-ATPase活性的比較結果顯示，與空白組比較，模型組Na+-K+-ATPase活性降低明顯，組間有顯著性差異（P＜0.05），說明造模成功。枳實生品高、低劑量組及枳實麩炒品低劑量組Na+-K+-ATPase活性均升高，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05），枳實麩炒品高劑量組Na+-K+-ATPase活性稍有降低，與空白組比較無顯著性差異；與模型組比較，枳實麩炒品高劑量組與之存在顯著性差異（P＜0.05）。結果見表1。

Ca2+-Mg2+-ATPase活性的比較結果顯示，與空白組比較，模型組、枳實生品高、低劑量組、枳實麩炒品低劑量組Ca2+-Mg2+-ATPase活性均降低，并且組間有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，枳實麩炒品高、低劑量組Ca2+-Mg2+-ATPase活性均有提高，且組間有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。結果見表1。

3.2? 枳實生品及麩炒品提取液對利血平致脾虛大鼠肝組織三羧酸循環相關代謝酶活性影響? CS活性的比較結果顯示，與空白組比較，模型組CS活性明顯降低，組間有顯著性差異（P＜0.05），說明造模成功。枳實麩炒品高劑量組CS升高最為明顯，與空白組比較無顯著性差異；與模型組比較，枳實麩炒品高劑量組與之存在顯著性差異（P＜0.05）。結果見表2。

ICD活性的比較結果顯示，與空白組比較，模型組、枳實生品及麩炒品低、高劑量組ICD活性均降低，并且均有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，枳實麩炒品高劑量組ICD活性有所提高，有顯著性差（P＜0.05）。結果見表2。

3.3? 枳實生品及麩炒品提取液不同劑量組對利血平致脾虛大鼠肝組織CaM、CaMK Ⅱ、p-CaMK Ⅱ蛋白表達影響? CaM蛋白表達量結果顯示，與空白組比較，模型組、枳實生品高劑量組、枳實麩炒品高、低劑量組CaM蛋白表達量均降低，組間比較有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，枳實生品低劑量組及陽性藥組與之有顯著性差異（P＜0.05）。CaMK Ⅱ蛋白表達量結果顯示，與空白組比較，利血平造模組、枳實生品高、低劑量組、枳實麩炒品低劑量組CaMK Ⅱ蛋白表達量均較低，并且組間有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，枳實麩炒品高劑量組、陽性藥組有顯著性差異（P＜0.05）。p-CaMK Ⅱ蛋白表達量結果顯示，與空白組比較，模型組，枳實生品高、低劑量組、枳實麩炒品低劑量組p-CaMK Ⅱ蛋白表達量較低，組間比較有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，枳實生品高、低劑量組，麩炒品高、低劑量組，陽性藥組均有顯著性差異（P＜0.05）、（P＜0.01）。結果見表3，如圖1。

4? 討論

在中醫臨床實踐和不斷發展過程中，諸多醫家均認識到脾（胃）生理功能的重要性以及脾虛證的臨床證候特點［10］。“脾主運化”與消化系統生理功能關系密切，如若建立脾虛證動物模型首先應考慮與脾運化功能失職相關的指標［11-13］。利血平屬于外周交感神經阻滯藥，其造成動物脾虛模型一定程度上反映類似的病理改變，和中醫脾虛證有高度相符性，是較經典的方法之一，具有條件易控制、模型較穩定的特點［14-18］。因此實驗中選擇動物注射利血平造成脾虛模型，以便能準確真實地反應枳實和麩炒枳實對脾虛大鼠病癥的影響。

Na+-K+-ATPase是細胞膜主動轉運中的重要離子泵，而Ca2+-Mg2+-ATPase參與糖的轉運等多種能量代謝過程，是衡量線粒體功能和能量代謝水平的一個重要的指標［19-21］。實驗選取Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase為考察指標，比較研究枳實生品及麩炒品提取液不同劑量組對利血平致脾虛大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase表達的影響。結果顯示，與空白組比較，模型組可以明顯抑制Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性，而枳實生品與麩炒品提取液，不論低劑量還是高劑量組均可以不同程度提高上述兩種酶的活性，與枳實生品比較麩炒枳實提高更加明顯。實驗結果反應出枳實飲片在一定程度可以通過提高肝組織細胞中維持細胞基本結構和功能穩態的Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性來改善大鼠脾虛癥狀，并且麩炒品改善效果優于生品。這一結果也說明枳實經麩炒后，健脾和胃作用增強。

三羧酸循環既是糖類、脂類和蛋白質分解代謝的共同途徑，又是它們代謝聯系的樞紐［22］。CS是線粒體中三羧酸循環重要反應步驟的關鍵酶，通常認為全身有氧能力的變化與CS活性的變化之間存在關系［23］。ICD是三羧酸循環過程中重要的調節酶之一，在能量代謝和生物合成代謝過程中發揮著重要作用［24］。實驗結果可以看出生品與麩炒品枳實均可不同程度升高病理狀態下CS，麩炒枳實較生品提高更為明顯。枳實麩炒品較生品可以升高脾虛證大鼠ICD的表達，可見麩炒枳實較生品能夠更好地促進三羧酸循環進程，進而改善脾虛癥狀。

CaM牽連許多細胞內生理過程，包括調節細胞各種酶的活性，調節平滑肌收縮和舒張，調節神經系統功能等［25-27］。實驗研究結果顯示，模型組CaMK Ⅱ信號通路關鍵分子CaM、CaMK Ⅱ及p-CaMK Ⅱ蛋白為低表達，而枳實生品和麩炒品可在一定程度提高上述三個蛋白表達。在CaM蛋白表達方面，枳實生品低劑量顯示高表達，而在CaMK Ⅱ和p-CaMK Ⅱ蛋白表達方面均是麩炒品高于生品，并且隨著劑量升高而升高，麩炒品高劑量升高最為明顯。可見麩炒品不論在三磷酸腺苷酶方面或是CaMK Ⅱ信號通路關鍵分子蛋白表達方面較生品提高更多，說明麩炒品能更好地改善脾虛大鼠癥狀。

綜上所述，利用脾虛模型大鼠比較研究枳實生品及麩炒品對肝組織三磷酸腺苷酶活性及CaMK Ⅱ通路CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達的異同，對研究枳實麩炒的炮制機理具有現實意義。通過實驗研究可以發現枳實生品及麩炒品均可以通過調節與物質、能量代謝密切相關的肝臟組織中的物質能量代謝酶及鈣調蛋白而更好地改善脾氣虛癥狀，并且麩炒品作用明顯強于生品。上述研究結果為解釋枳實經麩炒后生峻熟緩，增強健脾和胃作用的藥理藥效變化機制提供實驗依據。同時，隨著CaM第二信使重要性的確定，PLCγ1/IP3Ｒ信號分子對其的調控也將成為下一步實驗的研究重點，以便為進一步研究枳實去燥性和胃的炮制作用提供理論基礎。

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（收稿日期：2023-04-05? 編輯：劉? 斌）