光聲光譜在細菌性肺炎患者病原菌鑒定中的應用價值

劉靜莎，張健鵬

（1.北京市順義區(qū)醫(yī)院重癥醫(yī)學科，北京 101300；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心呼吸科，北京 100039）

人體呼出氣主要由氮氣、氧氣、二氧化碳、水和其他氣體組成；同時在呼出氣中存在一些濃度范圍在ppbv ～pptv 的揮發(fā)性有機物（痕跡氣體）[1]。揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）主要指的是在常溫的狀態(tài)下飽和蒸汽壓力超過133.32 Pa，且在常溫狀態(tài)下沸點處于50 ～260℃之間的有機化合物[2]。人體內的VOCs 是在人體組織的正常生理過程和與疾病相關的病理過程中產生的[3]。所有的細胞都會在一定程度上產生一些VOCs，其相對豐度和反應會導致呼出氣中的VOCs 譜發(fā)生特定條件下的變化[4]。人體新陳代謝的部分產物可經血液運送至肺部，通過氣體交換進入肺泡而出現(xiàn)在呼出氣中。當人體處于炎性反應、氧化應激等狀態(tài)時，體內代謝發(fā)生改變，其中一些揮發(fā)性物質會進入血液循環(huán)，并在血液流經肺泡進行氣體交換時通過呼出氣排出體外[5]。呼出氣體中VOCs 成分和量的不同，可反映人體不同的病理生理狀態(tài)。因呼出氣可揮發(fā)性有機物成分檢測具有無創(chuàng)、操作便捷、高靈敏度及高特異性等特點，近年來其被認為可能成為一種安全便捷的疾病早期診斷方法[6]。但目前的相關研究多采用氣相色譜、質譜等技術，這些檢測技術均存在著操作方法極其復雜、重復性差、檢測標準和方法不統(tǒng)一、對操作人員要求高等缺點，與相關實際臨床應用尚存在較大的距離。光聲光譜氣體檢測技術是利用光聲效應實現(xiàn)痕量氣體檢測的一項重要技術, 具有高靈敏度、高選擇性、零背景信號、可實時在線監(jiān)測等優(yōu)點, 在環(huán)境監(jiān)測、采礦冶金、能源電力、醫(yī)療衛(wèi)生等領域發(fā)揮著至關重要的作用[7]。本研究擬采用光聲光譜技術（Photoacoustic spectroscopy, PAS）進行相關檢測，同時觀察比較了細菌性肺炎患者的呼出氣與健康對照組的呼出氣中VOCs 光聲光譜檢測之間的差異，以期對細菌性肺炎的病原菌進行早期識別。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機選擇在某三甲醫(yī)院住院的痰細菌培養(yǎng)陽性的肺炎患者12 例（其中大腸桿菌肺炎4 例，肺炎克雷伯桿菌肺炎8 例）、醫(yī)院健康工作人員6 例作為觀察對象。肺炎患者作為肺炎組、健康工作人員作為健康對照組。肺炎組：（1）納入標準：①年齡18 ～80歲，性別不限；②確診細菌性肺炎；③連續(xù)三次痰細菌培養(yǎng)出同一種且單一的致病菌；④無吸煙史，無循環(huán)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病、腎功能不全等基礎疾病；⑤知情同意參與研究。（2）排除標準：①合并其他系統(tǒng)疾病；②需要進行有創(chuàng)或無創(chuàng)通氣的患者；③通氣或換氣功能障礙者；④無法配合正確收集呼出氣體的患者。健康對照組：（1）納入標準：①年齡18 ～80 歲，性別不限；②無吸煙史，無呼吸、循環(huán)、消化、泌尿及血液系統(tǒng)疾病；③近兩周內未發(fā)生急性呼吸系統(tǒng)感染；④知情同意參與研究。（2）排除標準：①近兩周內發(fā)生過急性呼吸系統(tǒng)感染者；②存在其他系統(tǒng)疾病者。

1.2 實驗器材

1.2.1 Tedlar 氣體采樣袋及外接一次性吹嘴 Tedlar 氣體采樣袋及外接一次性吹嘴由大連德霖氣體包裝有限公司提供( 見圖1.1)。Tedlar 氣體采樣袋容量為300 mL。反復利用時需用純氧氣進行反復充氣和抽氣，并在60℃條件下老化4 h（經過老化后的采樣袋能有效降低背景值，可以再次使用）。

圖1.1 Tedlar 氣體采樣袋

1.2.2 光聲光譜分析儀（PASTA-1001）PASTA-1001光聲光譜分析儀由中國航天科技集團北京某研究所研發(fā)( 見圖1.2)。主要參數：氣體采樣容積為30 mL；檢測時間30 min；檢測精度PPb 級；在0 ～40℃的工作條件下，其測量結果不會因環(huán)境溫度和氣壓的變化而產生漂移。

圖1.2 PASTA-1001 光聲光譜分析儀

1.3 實驗方法

1.3.1 受試者呼出氣的采集（1）第一次使用Tedlar采樣袋時，將其用蒸餾水清洗干凈，烘干，去除殘留物。之后重復使用時用純氧氣進行反復充氣和抽氣3次，以置換殘留氣體備用。（2）受試者晨起后保持空腹安靜狀態(tài)，在通風良好的室內平靜呼吸0.5 h，用清水進行口腔清潔后待測。（3）連接一次性吹嘴，打開夾子，囑患者向Tedlar 采樣袋中吹氣，反復呼吸數次，盡量使袋內氣體接近肺泡氣體濃度。（4）關閉夾子，于10 min 內連接光聲光譜儀進行檢測。

1.3.2 氣樣的光聲光譜測量（1）將PASTA-1001 光聲光譜檢測儀開機預熱至池溫達到45℃（此狀態(tài)下機器性能較穩(wěn)定）。（2）將Tedlar 采樣袋的出口端（夾閉狀態(tài)）用橡膠管連接到PASTA-1001 進氣閥管上，然后運行機器抽氣1 min 形成管道負壓（池壓為233 mBar）。（3）打開橡膠管抽氣，使儀器顯示壓力平衡后運行機器檢測，分別獲得初始實驗數據和初始光譜曲線（X 值表示波數 cm-1，Y 值表示幅值au）。本試驗選擇檢測波數范圍為1000 ～1250 cm-1，因為此波數段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機揮發(fā)性化合物，其中幅值與所測揮發(fā)性化合物的濃度成正比。（4）重復采用上述方法檢測其他標本。

1.4 數據分析

將各組光聲光譜圖分析結果采用Originpro 8.5 繪圖軟件處理后得到光聲光譜圖（X 值表示波數 cm-1，Y 值表示幅值au）。本試驗選擇檢測波數范圍為1000 ～1250 cm-1，因為此波數段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機揮發(fā)性化合物，其中幅值與所測揮發(fā)性化合物的濃度成正比。

2 結果

2.1 細菌性肺炎患者呼出氣與健康對照組呼出氣的光聲光譜檢測

為尋找大腸桿菌肺炎患者的特異性波峰，將大腸桿菌肺炎患者呼出氣與健康對照組呼出氣的光聲光譜測量結果進行逐一對比（見圖2.1）。得出大腸桿菌肺炎患者在1120 ～1126 波數段、1228 ～1232 波數段及1236 ～1238 波數段處出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組的波峰（圖2.1 A1、A2 為局部放大圖），而在其他波數段則未見明顯區(qū)別。

圖2.1 大腸桿菌肺炎患者與健康對照組呼出氣的光聲光譜檢測（圖2.1 A1、A2 為局部放大圖）

進一步將4 例大腸桿菌肺炎患者和6 例健康對照組人員進行一一對比（見圖2.2），我們發(fā)現(xiàn)4 例大腸桿菌肺炎患者的特征峰如下：（1）1236 ～1238 波數段：4 例大腸桿菌肺炎患者均有出現(xiàn)，出現(xiàn)頻率均為100%（見圖2.2 a2）；（2）1228 ～1232 波數段：4 例大腸桿菌肺炎患者均有出現(xiàn)，出現(xiàn)頻率均為100%（見圖2.2 a2）；（3）1120 ～1126 波數段：有2 例表現(xiàn)為上述的單峰，另外2 例表現(xiàn)為雙峰，該波數段的波峰在大腸桿菌肺炎患者中的出現(xiàn)頻率為50%（見圖2.2 a1）。

圖2.2 4 例大腸桿菌肺炎患者的光聲光譜檢測結果

在1120 ～1126 波數段，6 例健康對照組人員均出現(xiàn)與大腸桿菌肺炎患者不同的雙峰（見圖2.3 D1）。因此，大腸桿菌肺炎患者在1120 ～1126 波數段出現(xiàn)的單峰可初步將其與健康對照組相鑒別。而在1224 ～1228 波數段及1236 ～1238 波數段，6 例健康對照組人員中有4 例出現(xiàn)了與大腸桿菌肺炎相同的波峰（見圖2.3 D2）。可見，這兩個波峰對于區(qū)分大腸桿菌肺炎患者及健康對照組無特異性。因此，大腸桿菌肺炎患者在1120 ～1126 波數段出現(xiàn)的單峰，可作為大腸桿菌肺炎的特異性波峰（我們命名為E 峰），用于早期鑒別大腸桿菌肺炎。

圖2.3 健康對照組在與大腸桿菌肺炎相應部位出現(xiàn)波峰情況的放大圖

2.2 肺炎克雷伯桿菌肺炎患者與健康對照組呼出氣光聲光譜檢測結果的比較

與上組比較相同，對肺炎克雷伯桿菌肺炎患者呼出氣與健康對照組呼出氣的光聲光譜測定結果進行對比。從圖2.4 可以看出：肺炎克雷伯桿菌肺炎患者在1236 ～1238 波數段及1240 ～1242 波數段處出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組的波峰（圖2.4 B6 為局部放大圖），在其他波數段未見明顯區(qū)別。

圖2.4 肺炎克雷伯桿菌肺炎患者與健康對照組呼出氣的光聲光譜檢測結果

將6 例肺炎克雷伯桿菌肺炎患者逐一與健康對照組對比發(fā)現(xiàn)，6 例肺炎克雷伯桿菌肺炎患者在不同波數段出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組波峰的情況如下：（1）1236 ～1238 波數段：有3 例出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組的波峰（見圖2.5 b1）；（2）1240 ～1242 波數段：有3 例出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組的波峰（見圖2.5 b1）。

6 例健康對照組人員在不同波數段出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌肺炎相似波峰的情況如下：（1）1236 ～1238 波數段：有5 例出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌肺炎相似的波峰；（2）1240 ～1242 波數段：均未出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌肺炎相似的波峰（見圖2.5 D3）。因此，通過光聲光譜檢測結果中1240 ～1242 波數段波峰的存在與否可將肺炎克雷伯桿菌肺炎患者與健康對照組相區(qū)別。1240 ～1242 波數段波峰可作為肺炎克雷伯桿菌肺炎的特異性波峰（我們命名為K 峰）。

圖2.5 6 例肺炎克雷伯桿菌肺炎患者及6 例健康對照組人員在相應波數段出現(xiàn)波峰的情況

綜上所述，大腸桿菌肺炎患者及肺炎克雷伯桿菌肺炎患者可分別依據1120 ～1126 波數段（靈敏度為50%，特異度為100%）及1240 ～1242 波數段（靈敏度為50%，特異度為100%）與健康對照組初步相鑒別。

3 討論

PAS 是分子光譜學的一個重要分支，是基于光聲效應的一種微量氣體檢測方法。用一定頻率調制的光源照射物質分子吸收一定的光能后，在由受激態(tài)通過非輻射過程躍遷到低能態(tài)時，會產生同頻的聲波（光聲信號），這一現(xiàn)象稱為光聲效應[8]。PAS 主要是根據目標氣體的光聲信號隨著入射光的波長變化形成譜線，從而做到對目標氣體的即時識別。與傳統(tǒng)檢測技術相比，其具有高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性、樣品無需進行預處理、不消耗氣樣、可動態(tài)監(jiān)測、光譜范圍較廣及檢測快速等諸多優(yōu)點。因此其受到了國內外學者的廣泛關注。

與傳統(tǒng)光譜分析方法不同, PAS 主要是監(jiān)測物體吸收光能后產生的熱能中以聲壓形式表現(xiàn)出來的能量部分，即使在高反射弱吸收的情況下，吸收能也可被微音器檢測到[9]。紅外光譜由原子振動和分子轉動產生, 故又稱為分子的振- 轉光譜。紅外光譜有三個分區(qū)：（1）近紅外區(qū)，指波長為780 nm ～2.5 μm 的波數段；（2）中紅外區(qū)，指波長為2.5 μm ～25 μm的波數段；（3）遠紅外區(qū)，指波長為25 μm ～1000 μm的波數段[10]。氣體分子在紅外光譜區(qū)的吸收是由于分子振動或轉動的狀態(tài)變化或者分子振動或轉動狀態(tài)在不同能級間的躍遷而產生的[11]。

細菌的代謝較之人體代謝來說，具有代謝更加旺盛、代謝類型更加多樣的特點。不同的細菌含有的酶不完全相同，對營養(yǎng)物質的分解能力亦不一致，因而其代謝產物有區(qū)別，所產生的VOCs 種類有差異。根據此特點，可利用生物化學方法來鑒別不同細菌[12]。嚴冰[13]通過用細菌感染體外肺組織建立模型，檢測其產生的VOCs 發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染組存在十二烷、間-(1,1- 二甲基- 乙基)- 苯、十六醇三種特征性氣體成分，銅綠假單胞菌感染組則存在十二烷、間-(1,1-二甲基- 乙基)- 苯、2,4,6- 三(1,1- 二甲基- 乙基)-苯酸三種特征性成分。細菌感染人體后會產生相應的代謝產物，進而會出現(xiàn)在人的呼出氣中，而不同的氣體分子在用光聲光譜技術進行檢測時會在不同的波段產生不同形態(tài)及幅度的波峰。

本研究應用光聲光譜技術檢測細菌性肺炎患者及健康人的呼出氣并分析對比兩組的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌肺炎患者呼出氣在1120 ～1126 波數段出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組的特異性波峰（靈敏度為50%，特異度為100%），暫將其命名為E 峰（E 為Esherichia Coli 首字母）；肺炎克雷伯桿菌肺炎患者呼出氣在1240 ～1242 波數段出現(xiàn)區(qū)別于健康對照組的特異性波峰（靈敏度為50%，特異度為100%），暫稱其為K 峰（K 為Kleosiella Pneumoniaez 首字母）；但是這些特異性波峰所代表氣態(tài)物質的具體成分目前并不清楚，尚需進一步研究闡明。

人體新陳代謝的部分產物會隨血液流經肺部，并通過氣體交換進入肺泡，然后隨呼出氣呼出。當人體受到外界病原體入侵或本身代謝狀態(tài)改變，如發(fā)生炎性反應、氧化應激等狀態(tài)時，體內代謝發(fā)生改變，隨之呼出氣中的代謝產物也會有所不同，在光聲光譜檢測時便體現(xiàn)為波峰形態(tài)及位置的不同；依靠這些不同的波峰我們可以將肺炎患者及健康對照組初步區(qū)分。

綜上所述，將光聲光譜技術應用于細菌性肺炎病原菌的識別檢測，是對細菌性肺炎診斷的一次新的嘗試。目前可供參考的相關文獻及方法有限，本研究還存在一定的不完善和不足之處，比如因入選標準比較嚴格，本研究樣本量較小，結果的代表性不足；加之細菌產生的VOCs 在人體呼出氣中含量甚微，同時人體在細菌入侵引起的感染狀態(tài)時發(fā)生氧化應激所產生的VOCs 對細菌代謝物檢測也存在一定干擾。因此，在后續(xù)的研究中仍需擴大樣本量、改進研究方法，進而讓光聲光譜這一靈敏、即時、高效的檢測技術能夠盡早廣泛地應用于相關臨床早期診斷。