WISP 1基因多態(tài)性與胃癌的相關(guān)性研究

董英輝 張靜 邊浩鵬

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第3位，其中70%的患者來(lái)自亞洲，而中國(guó)患者占將近一半，且有初診晚，預(yù)后差的特點(diǎn)[1，2]。CCN蛋白家族與機(jī)體組織創(chuàng)傷修復(fù)密切關(guān)聯(lián)，在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[3]，Wnt誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(WISP1)系CCN家族的一員，作為Wnt信號(hào)通路下游的靶基因與許多惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4]，有研究顯示，與正常組織比較，胃癌組織中WISP1的mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)，高WISP1表達(dá)的胃癌患者總體生存期較差。多因素生存分析顯示，WISP1是胃癌患者重要的預(yù)后因素[5]。分子流行病學(xué)的研究顯示存在于基因上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點(diǎn)，可能通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)水平導(dǎo)致個(gè)體間的遺傳差異，從而造成腫瘤遺傳易感性的不同。因此本研究探討WISP1 rs2929973G/T、rs2929970 A/G SNPs與胃癌的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究包括310例胃癌患者和301例健康對(duì)照患者。310例胃癌患者系2016年1月至2018年12月在我院經(jīng)組織學(xué)檢查確診的住院患者。健康對(duì)照為在相同時(shí)間同一地區(qū)體檢正常且無(wú)消化道腫瘤家族史的個(gè)體。腫瘤患者及健康對(duì)照的年齡、性別、吸煙習(xí)慣及家族史情況均有專(zhuān)人詢(xún)問(wèn)獲得。最終選取年齡、性別與病例相匹配的301例健康者作對(duì)照。現(xiàn)在吸煙或者曾經(jīng)吸煙>5支/d，并且持續(xù)≥2年者定義為吸煙個(gè)體。所有研究個(gè)體簽署了書(shū)面知情同意書(shū)，研究由石家莊市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集及外周血白細(xì)胞DNA的提取 所有研究個(gè)體采集靜脈血5 ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，4℃冰箱保存，采血1周內(nèi)，采用天根DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3 WISP1 SNPs位點(diǎn)篩選 采用Haploview軟件，從HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選SNP位點(diǎn)，結(jié)合目前臨床已有的研究，考慮內(nèi)含子區(qū)域不編碼序列，選擇了位于WISP1 3-UTR區(qū)域的rs2929973G/T、rs2929970 A/G2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。

1.4 WISP1基因SNPs分型 采用(PCR-LDR)方法對(duì)WISP1基因rs2929973G/T、rs2929970 A/G SNP進(jìn)行基因分型。實(shí)驗(yàn)由上海捷瑞生物工程有限公司完成(http://www.generay.com.cn)。針對(duì)每1個(gè)SNP位點(diǎn)的各基因型均隨機(jī)選擇10%PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)照組基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析。病例組與對(duì)照組的年齡差異采用t檢驗(yàn)，病例組和對(duì)照組的基因型頻率分布比較均采用行×列表χ2檢驗(yàn)，以非條件 logistic 回歸方法計(jì)算表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(OR)及其 95%可信區(qū)間(CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征 胃癌患者組男209例,女101例;年齡40～82歲,平均年齡63.0歲；健康對(duì)照組男200例,女101例；年齡40～80歲,平均年齡59.7歲。肺癌患者組與健康對(duì)照性別比、年齡構(gòu)成比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。胃癌患者組吸煙比例為51%，明顯高于健康對(duì)照組40.2%(P<0.01)。按照第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期10例、Ⅱ期77例、Ⅲ期75例、Ⅳ期148例；按照Lauren分型，腸型胃癌133例，彌漫型胃癌152例，混合型胃癌25例。按照HER-2情況進(jìn)行分層，HER-2陽(yáng)性者29例，HRR-2陰性者281例。見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者與健康對(duì)照者特征分布 例(%)

2.2 WISP1基因rs2929973G/T SNP與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析

2.2.1 WISP1基因rs2929973G/T SNP的G和T等位基因在胃癌患者組和健康對(duì)照組的頻率分別為36.0%、64.0%和34.9%、65.1%。2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.69)，胃癌患者組GG GT TT基因型頻率分別為12.6%、46.8%、40.6%與對(duì)照組12.0%、45.8%、42.4%比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.92)。見(jiàn)表2。

表2 WISP1基因rs2929973G/T、rs2929970AG SNP在胃癌組和對(duì)照組中的分布 例(%)

2.2.2 根據(jù)吸煙情況進(jìn)行分層分析，吸煙人群中，胃癌組與正常對(duì)照組攜帶GG+GT、TT基因型的頻率分別為 57.0%、43.0%與57.9%、42.1%。不吸煙人群中，胃癌組與正常對(duì)照組攜帶GG+GT、TT基因型的頻率分別為58.6%、41.4%與57.8%、42.2%。2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。依據(jù)分期進(jìn)行分層分析，Ⅲ、Ⅳ期攜帶GG+GT基因的頻率為51.6%與Ⅰ、Ⅲ期 56.3%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。依據(jù)組織學(xué)分級(jí)進(jìn)行分層分析，GG+GT、TT基因型在胃癌G1+G1中的頻率分別為54.0%、46.0%，與G3的54.3%、45.7%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。按照Lauren分型進(jìn)行分層分析，GG+GT、TT基因型的率分別為53.4%、57.9%、52.0%與46.6%、42.1%、48.0%；按照HER-2情況進(jìn)行分層分析，HER-2陰性組GG+GT的基因型頻率為58.6%，與HER-2陽(yáng)性組的56.6%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 WISP1基因rs2929973G/T SNP與胃癌病理特征 例(%)

2.3 WISP1基因rs2929970A/G SNP與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析 WISP1基因rs2929970A/G SNP的A和T等位基因在胃癌組和對(duì)照組的頻率為59.0%、41.0%和56.5%、43.5%。2組比較無(wú)差異(P>0.05)。胃癌患者組AA AG GG基因型的頻率分別為31.3%、55.5%、13.2%，與對(duì)照組(28.0%、57.1%、14.9%)比較無(wú)差異(P>0.05)。分層分析發(fā)現(xiàn)吸煙人群中，胃癌組AA AG+GG基因型的頻率分別為 27.2%、72.8%與對(duì)照組(29.8%、70.2%)比較無(wú)差異(P>0.05)。不吸煙人群中，AA AG+GG基因型在肺癌組和對(duì)照組的分布頻率分別為28.9%、71.1%和30.6%、69.4%，2組比較亦無(wú)差異(P>0.05)。根據(jù)分期進(jìn)行分層分析，Ⅲ～Ⅳ期胃癌攜帶AG+GG基因型的頻率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(85.2%、74.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而組織學(xué)分級(jí)中，G3患者中AG+GG基因型的頻率(81.2%)高于G1+G2中AG+GG基因型的頻率(71.4%)P值接近0.05；根據(jù)Lauren分型進(jìn)行分層分析，與腸型胃癌患者比較，彌漫型胃癌中AG+GG基因型的頻率明顯升高(80.3% vs 69.9%)(P<0.05)，而混合型胃癌與腸型胃癌比較，AG+GG基因型的頻率無(wú)差異(P>0.05)。根據(jù)HER-2情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示AG+GG基因型在HER-2陰性及HER-2陽(yáng)性中的分布無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

3 討論

CNN家族是一組結(jié)構(gòu)相似的蛋白家族，包含有6個(gè)成員，富含半胱氨酸的分泌蛋白61(Cyr61)、結(jié)綈組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、腎母細(xì)胞瘤過(guò)度表達(dá)基因(Nov)，WISP1、WISP2和WISP3[6]。其中WISP1由367個(gè)氨基酸組成，富含38個(gè)保守的半胱氨酸殘基和4個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)，在多個(gè)器官中均有表達(dá)，具有調(diào)節(jié)生存、增殖、遷移的功能，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用[7]。既往Chiang等[8]的研究結(jié)果顯示W(wǎng)ISP1在乳腺癌患者中高表達(dá)，體外試驗(yàn)顯示W(wǎng)ISP1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)WISP1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)。在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)了相似的研究結(jié)果，WISP1在結(jié)腸癌中的高表達(dá)，且與分期、病理類(lèi)型及預(yù)后密切相關(guān)，體內(nèi)試驗(yàn)提示抑制WISP的表達(dá)可延緩腫瘤的生長(zhǎng)[9]。同樣，WISP在胃癌中的表達(dá)顯著升高，上調(diào)WISP1表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、化療療效和預(yù)后相關(guān)[10]。目前的研究表明存在于WISP1 基因上的單核苷酸多態(tài)可能通過(guò)改變其表達(dá)，從而影響了腫瘤的發(fā)生與預(yù)后[11]。既往已有研究證實(shí)WISP1 SNPs在惡性腫瘤中的作用[12-17]。目前尚未由WISP1 SNPs 與胃癌的相關(guān)研究。本研究結(jié)果顯示rs2929970A/G 單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)中G等位基因型與胃癌分期、組織學(xué)分級(jí)及Lauren分型相關(guān)。

表4 WISP1基因rs2929970A/G SNP與胃癌臨床病理特征 例(%)

rs2929970位于WISP1的3’-UTR區(qū)，3’UTR為基因的非編碼區(qū),miRNA通過(guò)與3’-UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮作用，影響mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)，在不同水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響疾病的發(fā)生及預(yù)后[18]。WISP1基因的3’UTR區(qū)域長(zhǎng)約5.0 kb。有研究顯示，miRNA hsa-miR-99a可與WISP1 3’-UTR區(qū)域結(jié)合，且當(dāng)rs2929970A等位基因換成G等位基因時(shí)，WISP1 mRNA的結(jié)構(gòu)變化，穩(wěn)定性下降。最小自由能由-22.6kal/mol減低為-18.5 kal/mol，提示rs2929970可能是一個(gè)功能性的多態(tài)位點(diǎn)。已有研究表明，rs2929970 A/G 多態(tài)位點(diǎn)中，攜帶G等位基因型與血壓升高有關(guān)[19]；Urano等[20]的研究顯示rs2929970 A/G 多態(tài)位點(diǎn)可能與脊柱骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，惡性腫瘤中，Lau等[16]的研究顯示rs2929970與口腔癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，在口腔鱗狀上皮癌中，AG+GG基因型在晚期口腔鱗癌及≥2 cm的口腔癌的頻率明顯高于早期及<2 cm的腫瘤，與上述結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)AG+GG基因型在Ⅲ～Ⅳ期胃癌，組織學(xué)分級(jí)差以及彌漫型胃癌中的頻率增高。而在乳腺癌、肝癌中均未觀察到該位點(diǎn)與疾病發(fā)生的相關(guān)性[12，13]，提示W(wǎng)ISP1 rs2929970可能與人群、疾病等相關(guān)。目前尚不清楚WISP1 rs2929970的具體作用機(jī)制，結(jié)合臨床一項(xiàng)納入838例進(jìn)展期胃癌患者(轉(zhuǎn)移占88%)的回顧性研究顯示，HERZ陽(yáng)性彌漫型胃癌患者生存結(jié)局最差[22]，GG+GA基因型在彌漫型胃癌中分布頻率明顯升高，提示W(wǎng)ISP1 rs2929970在胃癌中發(fā)揮了一定的作用，G等位基因可能與胃癌的預(yù)后相關(guān)。

本研究未發(fā)現(xiàn)rs2929973與胃癌的相關(guān)性，既往在宮頸癌及肝癌的研究得出了一致的結(jié)果[13,14]。然而有研究顯示攜帶WISP1 rs2929973 GG + TT基因型的乳腺癌患者雌孕激素受體陽(yáng)性的可能性幾乎是攜帶GT基因型患者的2倍[12]。攜帶WISP1 rs2929973 (GT + GG)變異基因的膀胱尿路上皮癌女性，發(fā)生侵襲及腫瘤生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)更高[15]。吸煙是胃癌的危險(xiǎn)因素之一，本研究中胃癌組吸煙比率明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)吸煙與胃癌的關(guān)聯(lián)，我們的研究本研究并未發(fā)現(xiàn)吸煙與WISP1 SNPs的相關(guān)性。

綜上所述，本研究顯示W(wǎng)ISP1 rs2929970 多態(tài)位點(diǎn)可能與胃癌的預(yù)后有關(guān)，WISP1可能是預(yù)后相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。