PI3K/AKT信號通路與新生血管性眼病的相關研究進展

陳來嬌，鄭磊，張國明

(1.暨南大學第二臨床醫學院，廣東 深圳 518040；2.深圳市眼科醫院/暨南大學附屬深圳眼科醫院，深圳市眼病防治研究所，廣東 深圳 518040)

血管生成在胚胎發育、組織修復等生理過程中發揮重要的作用，一旦血管生成的調控機制失衡將會誘發病理性新生血管，給機體帶來諸多危害。眼球是高度精密的視覺系統，擁有豐富的血液供應，各種各樣的病理因素可能會促發血管的異常增殖而導致眼部新生血管性疾病，例如糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)、角膜新生血管(corneal neovascularization，CoNV)等，這些病變會嚴重威脅患者的視功能。因此，眼部異常血管調控機制以及拮抗其發生發展一直是研究的熱點。而近年來的研究證實磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路[1]參與了新生血管性眼病的病理進程，本文將就此展開說明。

1 PI3K/AKT信號通路概述

PI3K本質上是一種激酶，存在于細胞質，具有蛋白激酶及磷脂激酶的雙重活性。PI3K包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅰ型的底物主要是磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、3-磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP)及3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，3,4-diphosphate，PIP2)；Ⅱ型的底物主要是PI及PIP，Ⅲ型的底物主要為PI。Ⅰ型PI3K又包括ⅠA和ⅠB亞型，前者由調節亞基(p58)和催化亞基(p110)組成，其中p58包含SH2、SH3兩個重要結構域。在正常情況下p58亞基與p110亞基結合導致PI3K失活，而PI3K的激活存在2種方式：一種是細胞受到某些含有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子的刺激，后者所包含的磷酸化的酪氨酸殘基會與p58亞基的SH2 結構域相互作用，進而解除p58 對p110 的抑制作用，從而激活PI3K；另一種方式是通過Ras 蛋白和p110亞基直接識別并結合導致PI3K 活化。PI3K 激活后會導致PIP2轉變為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(3,4,5-phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)，PIP3 作為第二信使可以與細胞內含有PH 結構域的AKT相互結合，導致AKT 轉位于細胞膜上并獲得相應的催化活性進行下一步的信號轉導。

AKT又稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是PI3K下游的關鍵蛋白，存在于細胞質中，AKT包括PH 結構域、催化結構域及調節結構域。在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)和 PDK2的分別作用下，蘇氨酸蛋白和絲氨酸蛋白會發生磷酸化，當二者全部磷酸化后AKT 才被激活。激活的AKT由細胞膜再次轉移到細胞質或細胞核內，進而繼續靶向調控下游信號分子，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、Bad、周期蛋白D1、核轉錄因子κB等的表達。通過PI3K/AKT 信號通路的激活，可以對細胞生長、增殖、凋亡[2]、自噬[3]及細胞周期等多種生理功能發揮調控作用。

PI3K/AKT信號通路在生理和病理的血管生成中均發揮著重要作用，PI3K/AKT通路促進血管形成的機制為：活化的 AKT磷酸化內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)使其激活，激活產生的一氧化氮可刺激血管舒張、血管重塑和血管生成；PI3K/AKT信號還可通過多種途徑上調缺氧誘導因子(hypoxiainducible factors-1α，HIF-1α)，促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其他血管生成因子的表達和分泌，刺激血管生成[4]。

2 PI3K/AKT與病理性新生血管眼病

2.1 PI3K/AKT與高糖模型DR是糖尿病最常見、最主要的微血管并發癥之一，已經成為當前全球致盲的重要原因。其基本病理改變是視網膜的血-視網膜屏障的破壞，疾病晚期會合并視網膜新生血管形成、黃斑水腫，甚至視網膜脫離，導致失明[5]。根據疾病的進展程度可以分為非增殖期糖尿病性視網膜病變和增殖期糖尿病性視網膜病變。高血糖是公認的DR發生和發展的主要危險因素，此外DR還與多元醇代謝、糖基化終產物、甘油二酯、蛋白激酶C系統、氧化應激和自由基、炎癥反應以及細胞因子等有關[6]，但至今其發病機制尚未完全闡明。近年來的研究證實，DR的發病進展與PI3K/AKT信號通路的異常活化密切相關。

視網膜病理性新生血管生成是DR患者致盲的主要原因，因此探索高血糖是如何引發這些血管內皮細胞增殖、“萌芽”一直是研究的熱點。DJ-1在多種內皮細胞類型中發揮作用，包括人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和角膜內皮細胞。Tian等[7]發現DJ-1過表達可促進HUVECs增殖，抑制HG誘導的HUVECs Bcl2/Bax比值的降低和高糖激活的ROS的產生。過表達DJ-1可增加p-AKT/AKT比值、eNOS激活和NO的產生，并且這些趨勢可被PI3K抑制劑LY294002部分逆轉。此外，Wu等[8]在體外高糖模型培養的人視網膜血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC)中發現IA型PI3K的催化亞基(p110)明顯高表達，可以進一步激活AKT而促進細胞增殖、遷移和體外成管。同樣運用HRMEC，何靜等[9]在高糖模型中發現高糖可誘導HRMEC中 miRNA 146a表達下調，而上調miRNA 146a表達可能通過降低白細胞介素-17A表達進而抑制PI3K/AKT通路激活，有效地降低高糖誘導的HRMEC增殖和新生血管生成。最近的研究報道，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)促進血管生成，并可能影響增殖、轉移和凋亡[10]，EGFR的表達預示著DR的進展，Zhou等[11]首次證實成纖維細胞生長因子7(fibroblast growth factor 7，FGF7)在DR大鼠模型中高表達可促進內皮細胞和視網膜周細胞的增殖、遷移和侵襲；而miR-199a-3p通過靶向調控FGF7和抑制EGFR/PI3K/AKT通路的激活，從而減少血管生成，該研究為尋找DR的治療方法提供了新的方向。以上研究初步證實了長期的視網膜高糖微環境可以通過PI3K/AKT信號通路的活化參與DR 病理性血管的生成。

視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)參與構成視網膜外屏障，對于維持正常的視網膜功能和穩態具有重要的作用。但由于RPE介于視網膜神經上皮層與脈絡膜毛細血管層之間，容易受到體內高血糖的影響。大量的文獻已經證實長期細胞內的高血糖紊亂會損害RPE的功能，參與DR的發病與進展，但機制不明。Liu等[12]發現在DR小鼠模型的RPE中，AKT1和AKT2的活性是相互調節的，AKT2基因敲除后通過代償性上調AKT1的磷酸化水平，抑制血管損傷、炎癥細胞因子的釋放從而減輕糖尿病引起的視網膜異常，因此，靶向調控RPE中AKT1活性可能是治療DR的一種新方法。同樣是運用RPE細胞的體外實驗，Treins等[12]用COCl2模擬DR缺氧狀態發現可以明顯增加HIF-1α和VEGF的表達，并且是通過PI3K/AKT/mTOR信號通路發揮作用，一旦使用PI3K的抑制劑后，缺氧狀態下HIF-1α和VEGF的表達量隨即降低。Lu等[14]通過建立DR模型及結合雙熒光素酶基因測定評估microRNA-21和PTEN之間的靶向關系，發現DR大鼠視網膜組織中觀察到miR-21和PI3K/AKT/VEGF相關基因表達增加，PTEN表達減少。其結果表明，miR-21過表達可能通過抑制PTEN表達激活PI3K/AKT/VEGF信號通路，從而潛在地刺激DR大鼠的視網膜血管內皮細胞活力和血管生成。同樣地，Wang等[15]高糖模型中發現高糖降低HRMEC的 miR-199a-3p的相對表達水平，而miR-199a-3p過表達可通過抑制VEGF表達調節PI3K/AKT通路改善高糖刺激的HRMEC的血管生成。由此可見，PI3K/AKT信號通路是通過多種細胞交互影響以及復雜的信號網絡參與DR的發病和進展。

2.2 PI3K/AKT與脈絡膜新生血管模型脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是眼內新生血管的重要表現形式之一，與眼部多種疾病有關，如AMD、高度近視黃斑變性、眼組織胞漿菌病、特發性脈絡膜視網膜炎、眼部腫瘤以及眼外傷等。CNV 常累及黃斑，引起反復出血、滲出、瘢痕形成，嚴重損害中心視力。迄今為止，CNV相關疾病的治療仍是眼科學研究領域的熱點。但其生成機制復雜多樣，既包括多種細胞因子的參與，又包括一些視網膜病理結構的改變，例如Bruch膜損傷、RPE擾亂等[16]。近年來，一些研究發現PI3K/AKT信號通路也參與了CNV的形成。

激光誘導CNV動物模型是目前公認的研究CNV的重要手段。大量的文獻已經證實HIF-1以及VEGF在CNV發病中發揮著重要的作用，但對于它們的調控機制尚未明確。Yang等[17]運用激光誘導兔CNV模型，發現激光作用可以明顯上調p-AKT的表達，并且增高峰值位于激光誘導后3 d，與此同時會伴隨著HIF-1和VEGF的表達增加。而在動物玻璃體內注射PI3K抑制劑LY294002后，HIF-1和VEGF的表達量明顯降低，伴隨著CNV的滲漏面積以及厚度明顯減少。Yang等[18]發現整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)通過PI3K/AKT通路和MEK/ERK通路抑制培養的RPE細胞中HIF-1b、SDF-1b和VEGF的表達，而抑制ILK表達可以明顯抑制CNV生長；以上2個研究均初步證實了PI3K信號通路通過調控HIF-1和VEGF的表達參與CNV的發生。對氧化應激具有保護作用的藏紅花，可促進炎癥反應，進一步促進CNV的形成，因此抗氧化應激已成為CNV治療的靶點方向[19]。Qin等[20]分別在過氧化氫誘導的氧化應激模型及小鼠激光誘導CNV模型中證實藏紅花在體內和體外均有抑制CNV的作用，其中藏紅花通過抑制胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)表達，導致PI3K、PDK1/2、AKT和BAD的磷酸化水平也降低，證實PI3K-PDK1/2-AKT-BAD信號通路參與了CNV的發病過程。

除此之外，在體外細胞模型中一些研究也證實PI3K參與CNV的形成。Jin等[21]將恒河猴脈絡膜-視網膜內皮細胞(RF/6A)置于低氧環境下培養發現可以增加HIF-1α和VEGFR2的表達，促進RF/6A細胞增殖以及基質膠中細胞成管。這些細胞生物學能力的增加與細胞內PI3K通路的活化相關，p-AKT表達明顯增強。而一旦使用PI3K抑制劑LY294002預處理后，低氧環境下RF/6A細胞的增殖和成管能力明顯減弱，由此佐證了PI3K信號通路的激活對于CNV形成的重要性。

同樣是利用RF/6A細胞系，Zhu等[22]通過在細胞培養液添加COCl2建立體外缺氧模型，發現p-PI3K、p-AKT和VEGF的表達上調，而抑制PI3K通路后，VEGF的表達明顯下降同時伴隨缺氧環境下RF/6A細胞的遷移和成管能力明顯減弱。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)被證實在靈長類RF/6A、RPE細胞和其他類型的視網膜細胞中下調促血管生成因子，如VEGF。Zhang等[23]在小鼠CNV模型中評估了玻璃體內注射RSV的應用，并使用脈絡膜內皮細胞進行了體外檢測，發現玻璃體內注射RSV對CNV有抑制作用，其機制可能是通過抑制內皮細胞遷移、VEGFR2的磷酸化而實現的。而Wu等[24]的研究進一步證明PI3K/AKT信號通路參與影響 CNV 形成。他們在使用激光誘導CNV動物模型及RF/6A細胞系探究氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein ，OxLDL)與CNV形成的分子機制中發現，OxLDL通過在早期增加 VEGF 的表達，激活 MEK/ERK 途徑來影響 CNV 的形成，再通過激活 PI3K/AKT 信號通路，誘導 TGF-β2/Smad 信號軸，從而導致內皮-間充質轉化，影響 CNV 形成的后期。

除了上述動物和細胞的功能實驗驗證外，部分PI3K/AKT信號通路抑制劑拮抗CNV的研究也佐證了該通路在CNV形成中的重要作用。GSK2126458是已被證實的PI3K和 mTORC1/2的靶向抑制劑，Ma等[25]將其作用于激光誘導的小鼠CNV模型中，發現該藥物可以減輕脈絡膜血管滲漏和減少CNV面積，與抑制PI3K/AKT/mTOR通路后下調多個促血管生成因子表達有關，包括VEGF和PDGF等。GNE-947是另一種已被證實的PI3K和mTOR靶向抑制劑，Liu等[26]將其用于HUVECs的體外實驗以及激光誘導CNV兔模型中，發現GNE-947不僅可以抑制HUVECs的體外增殖，還可以發揮拮抗動物模型中CNV形成效應，其潛在機制與GNE-947抑制了VEGF-VEGFR2對血管內皮細胞內PI3K/AKT通路的活化有關。因此，PI3K/AKT信號通路參與CNV的形成，而深入研究此通路也將進一步了解CNV的生成機制，為臨床治療提供新靶點。

2.3 PI3K/AKT與氧誘導視網膜病變模型氧誘導視網膜病變(oxygen induced retinopathy，OIR)模型具有模擬人類PDR部分病理生理過程的效應，也是常用的研究ROP發病機制和防治的重要實驗工具，是目前研究該類型疾病最為重要的實驗方法之一，可以為視網膜新生血管性疾病的防治提供重要依據[27-28]。ROP是早產兒尤其是伴有低體重兒發生的一種視網膜毛細血管發育異常化的雙側性眼病，表現為視網膜缺血、新生血管形成和增生性視網膜病變，重者可以引起視網膜脫離而導致永久性失明[29]。由于其后果嚴重，對患兒及其家庭造成巨大傷害，ROP 也日益引起人們的重視。目前ROP 的確切病因仍未明確，真正的發病機制尚不十分清楚。

Apelin是一種血管活性肽，為孤兒G蛋白偶聯受體-血管緊張素受體樣蛋白J受體(angiotensin receptor-like 1，APJ)的內源性配體，廣泛分布于全身的組織和細胞，在維持機體穩態、血糖代謝以調節免疫等方面發揮重要作用。最近的研究顯示在OIR小鼠模型中Apelin還可以促進缺氧誘導的視網膜病理性血管生成，潛在機制正是與p-mTOR、p-AKT的過表達有關[30]。

富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，Cyr61)是一種與ECM相關的立早基因編碼蛋白，在發育和病理狀態下，其主要表達在血管化和骨骼生長部位。Di等[31]在OIR小鼠模型中發現缺氧條件下可以明顯增加視網膜病理性血管的數量，伴隨著Cyr61、PI3K和AKT的表達上調。而在小鼠玻璃體腔內注射Cyr61的siRNA后則會明顯減少病理性新生血管生成，并且Cyr61的表達被證實與PI3K通路的活化有關。此外，Di等[32]在缺氧條件下用 LY294002處理人臍靜脈內皮細胞，發現LY294002通過下調 PI3K、 AKT 和 VEGF 在體內外的表達來抑制視網膜新生血管，主要由于 LY294002易于通過細胞膜并通過競爭性抑制 PI3K 亞基中的 ATP 結合位點來抑制 MAPK活性。

為了探究普萘洛爾影響ROP的潛在機制，Su等[33]建立小鼠OIR模型，發現腹腔注射普萘洛爾的小鼠中穿透視網膜內界膜的血管內皮細胞核數量減少，初步證實了普萘洛爾對 ROP 的治療效果，進一步分析發現OIR 小鼠 HIF-1α 和 PI3K/AKT/ERK 通路蛋白水平顯著升高，表明 PI3K/AKT/ERK/HIF-1α 軸與普萘洛爾誘導的 ROP 緩解相關。

胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF-2)是胰島素樣生長素家族的成員之一，IGF-2在血管生成過程中促進視網膜微血管內皮細胞遷移和血管形成。Zheng等[34]使用生物信息學技術比較了IGF-1、IGF-2、IGF-1R和IGF-2R的氨基酸序列，鑒定出一種新的12個氨基酸，具有LCGGELVDTLQF序列的肽(命名為CW-703)，在小鼠OIR模型觀察到磷酸化和VEGF的表達增加，提出CW-703可能通過阻斷典型信號通路：CW703與IGF-1R結合的IGF競爭，抑制IGF-1R和下游信號分子PI3K/AKT的磷酸化，導致VEGF表達減少抑制視網膜新生血管。

由以上可以看出，PI3K/AKT通路參與介導的ROP發病是需要通過不同的中間媒介蛋白發揮作用，可能并不是簡單地調控VEGF的表達來發揮促血管生成的效應。進一步探索其相關媒介蛋白，將有助于了解ROP的發病機制并發現更多可能有效的治療手段。

2.4 PI3K/AKT與角膜新生血管模型無血管化是角膜的主要特性，但是在外傷、感染等病理變化時，從角膜緣血管網形成的新生毛細血管會逐漸侵入角膜而形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CoNV)。CoNV可引起角膜正常微環境的破壞，使眼前節段相關的免疫赦免偏離，也會導致角膜組織瘢痕化和持續性炎癥，從而最終致盲。因此揭示CoNV的發病機制及尋找有效的治療方法仍是急需解答的問題。

堿燒傷誘導動物CoNV是研究該疾病最常用的體內實驗方法，基于此已經有大量的研究證實PI3K/AKT參與CoNV的發病。Li等[35]證實堿燒傷會誘導兔角膜組織中DNA甲基化修飾，從而進一步增加PI3K/AKT通路的下游效應子TSC1和mTOR的表達，上調VEGF水平引起CoNV生成。EZH2屬于DNA甲基化修飾中比較經典的甲基轉移酶，Wan等[36]發現EZH2的表達與堿燒傷后動物CoNV的產生呈正相關，而藥物性拮抗EZH2的表達后，可以抑制堿燒傷導致的氧化應激反應和病理性新生血管生成，其機制是EZH2的下調干擾了PI3K/AKT的信號轉導，導致該通路下游靶點FoxO3a 的表達減少，而FoxO3a正是與血管生成密切相關。既往研究表明，沉默S100 鈣結合蛋白A4(S100 calcium binding protein A4，S100A4)基因后，可抑制堿燒傷后CNV形成[37]，Wang等[38]在兔角膜堿燒傷模型中進一步研究其機制發現，S100A4基因在兔角膜基質細胞中沉默時，VEGF和TNF-α的mRNA和蛋白水平降低，PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平降低，推測沉默基因S100A4通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而抑制兔角膜基質細胞的炎癥反應和自噬，提出了以S100A4為靶點的角膜修復方法。

除了上述的復雜機制調控外，部分藥物對于CoNV生成抑制的研究，比較簡單清晰地佐證了PI3K/AKT通路參與了CoNV的生成。例如，Shen等[39]將黃嘌呤素用于角膜堿燒傷的小鼠模型研究中，發現能夠抑制CoNV的形成，其機制主要是黃嘌呤素能顯著抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，下調VEGFR2表達，從而抑制CoNV的形成。DCZ3301是一種新型的芳基胍基化合物，Xu等[40]在堿燒傷誘導的CoNV小鼠模型中發現DCZ3301可明顯縮小角膜新生血管面積，減輕角膜基質水腫，潛在的機制也是由于DCZ3301可以降低PI3K和AKT的磷酸化水平有關。Chen等[41]觀察到在堿燒傷兔模型中尼達尼布可以顯著抑制角膜CoNV及減少堿燒傷角膜組織的病理變化，主要由于局部應用尼達尼布降低堿燒傷誘導的VEGF表達，其機制可能與尼達尼布抑制堿燒傷刺激的AKT、p-AKT等的上調有關，其有可能預防CoNV的形成。CoNV的形成與PI3K/AKT信號通路的表達緊密相關，深入探索PI3K/AKT通路將有助于發現CoNV的發病機制、預防用藥及有效的靶點治療。

3 總結與展望

眼球是一個精密的視覺器官，任何部位異常的新生血管形成都可能會給患者的視功能帶來損害。而作為一種由多種因素導致的病理改變，這些異常新生血管的生成和調控機制具有一定的相似性，同時又是復雜多樣的。本文綜述了PI3K/AKT信號通路在部分眼部病理性新生血管中的重要作用，使用模型如DR高糖模型、激光誘導的CNV模型、OIR模型及CoNV模型等。此外，本綜述還挖掘了一些具有抑制血管生成效應的通路靶向抑制劑，例如LY-294002、LY294002、GSK2126458、GNE-947、DCZ3301等，其良好的抗病理性血管生長的作用預示著它們在未來的研究中可能具有更高的價值。許多眼部疾病的進展與異常新生血管密切相關，因此，未來可以更具傾向性地研究PI3K/AKT信號通路在這些疾病中的作用，以提供更多的臨床治療策略。