華蟾素對大鼠腹腔腸粘連影響機制的實驗研究

張好生 單連梅 孫汝萌 宮紅彥 王永 李強 金曉

[關鍵詞]華蟾素；腹腔腸粘連；大鼠；轉化生長因子-β1；腫瘤壞死因子-α

腸粘連是外科手術后的一種常見并發癥，常導致腸梗阻，嚴重危害患者的健康。其機制與組織缺血、損傷以及異物刺激引發的局部過度炎癥反應有關，急性炎癥期滲出物如果不能充分溶解、吸收，成纖維母細胞便會產生膠原，膠原沉積導致腹腔內永久性粘連[1-2]，腫瘤壞死因子、轉化生長因子、白介素等細胞因子在其中可能起重要的調節作用[3]，臨床上尚無理想的藥物預防腸粘連。華蟾素注射液是我國自行研制的，由中華大蟾蜍皮制成的水制劑，性質穩定，具有清熱解毒、利尿消腫、化結潰堅作用，臨床常用于抗腫瘤的治療[4]。華蟾素能抑制血管通透性，減少炎性滲出[5]，在治療胸腹水方面取得了一定的療效[6]，華蟾素還可以保護胃腸道黏膜屏障，減緩黏膜的損傷，也可以抑制腹瀉和結腸炎等不良反應[7-8]，據此推測，華蟾素的抗炎作用可能同樣適用于腹腔內損傷，在術后防治腸粘連方面可能發揮一定的作用，經文獻檢索未發現該方面的報道。

本實驗觀察華蟾素腹腔灌注對術后腹腔粘連的影響，現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40只雄性SD大鼠，SPF級，體重220～250g，6周齡，濟南朋悅實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（魯）2014-0007。飼養期間給予大鼠無菌飼料飲用水。本實驗經動物實驗倫理委員會批準通過，批件編號：煙山倫準2022048號。

1.1.2 實驗藥品及試劑 華蟾素注射液（安徽華潤金瞻藥業股份有限公司，國藥準字Z34020274）；透明質酸鈉凝膠MSHG（上海建華精細生物制品有限公司，批號：18033012，規格：10mg/ml）；轉化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器 主要儀器：AU480全自動生化分析儀（美國Beckman公司）；HeraeusMultifugeXIR離心機（美國賽默飛）。

1.2 實驗方法1.2.1 動物分組 40只大鼠隨機分為4組：假手術組（開關腹組）、對照組（腸粘連模型對照組）、透明質酸鈉組、華蟾素組，每組各10只。

1.2.2 制備腸粘連模型 大鼠適應性飼養1周，禁食不禁水12h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，神志消失后將大鼠仰臥固定于解剖盤內，碘伏消毒胸腹部皮膚。下腹部正中長2cm直切口進腹，提出切口外確認盲腸后，假手術組關腹。其余三組Ellis法制備大鼠腸粘連模型[9]，提出盲腸，鹽水紗布均勻摩擦漿膜面，損傷區域約1cm×2cm，摩擦至出現微小出血點為止，滴一滴無水乙醇于創面加重損傷，然后用血管夾夾閉盲腸系膜動脈2min，造成局部缺血再灌注損傷。盲腸相對的腹壁上用手術刀刮出1cm×1cm大小的區域損傷面，滴一滴無水乙醇加重損傷。然后用3-0VCP772D可吸收線將盲腸與腹壁損傷面縫合一針固定，防止盲腸游移，確保粘連形成。關閉腹腔，分籠飼養（20℃～25℃）8d，正常飲食飲水。造模過程中無大鼠死亡。

1.2.3 給藥 關閉腹腔后，假手術組和對照組5ml注射器腹腔內注入生理鹽水5ml/kg[1]，連續3d腹腔注射同劑量的生理鹽水。透明質酸鈉組和華蟾素組關閉腹腔后腹腔內分別注入5ml/kg透明質酸鈉和5ml/kg華蟾素[10]。

1.3 指標檢測及評價標準

1.3.1 觀察腹腔內粘連形成情況 頸椎脫臼法處死大鼠，腹部“U”形切開，觀察腹腔內狀況。Nair[11]5級分類法進行粘連程度分級評分，即腹腔內完全無粘連為0級；內臟間或內臟與腹壁間一條粘連帶為Ⅰ級；二條粘連帶為Ⅱ級；多于二條粘連帶，而內臟未直接粘連到腹壁為Ⅲ級；內臟直接粘連到腹壁，不管粘連帶多少均為Ⅳ級。

1.3.2 靜脈血TNF-α濃度和腹水TGF-β1濃度檢測 眼眶取血0.5ml，收集腹水0.2ml，分別于-80℃低溫保存，酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）檢測靜脈血TNF-α濃度和腹水TGF-β1濃度。

1.3.3 病理學檢測 取盲腸組織及其對側5mm×5mm腹膜和粘連組織，10%多聚甲醛固定。使用梯度乙醇脫水后，常規石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察炎癥細胞浸潤情況。粘連纖維帶組織常規石蠟包埋、切片，Masson三色染色，光鏡下觀察纖維組織增生情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。粘連程度分級采用完全隨機設計的秩和檢驗，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 華蟾素對大鼠腸粘連的大體觀察

假手術組傷口周圍無粘連或有微小粘連，粘連等級在0～Ⅰ級，以0級為主；對照組均發生粘連，且粘連帶多于兩條，少部分分離出血，粘連等級在Ⅲ～Ⅳ級，以Ⅲ級為主；透明質酸鈉組粘連以1～2條粘連帶為主，等級以Ⅰ級為主，少部分為Ⅱ級；華蟾素組粘連數量少且不緊密，很容易分離，等級以Ⅰ級為主，部分為0級。華蟾素組與對照組比較，粘連明顯減輕，華蟾素組明顯優于對照組。華蟾素組與透明質酸鈉組比較，平均秩略微好一點，粘連減輕，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1和表1～2。

2.2 TGF-β1和TNF-α濃度比較

對照組與假手術組比較，TGF-β1及TNF-α顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；透明質酸鈉組與假手術組比較，TGF-β1及TNF-α升高，差異有統計學意義（P<0.05）；華蟾素組與假手術組比較，差異無統計學意義（P>0.05），華蟾素組與對照組比較，TGF-α1及TNF-α顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），與透明質酸鈉組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.3 粘連組織中炎癥程度和粘連程度的比較

光鏡下炎癥程度比較：假手術組炎癥損傷輕，光鏡下可見盲腸和腹膜間見少量炎癥細胞浸潤或無炎癥細胞浸潤；對照組粘連組織中可見纖維組織增生、大量急慢性炎癥細胞浸潤，部分呈彌漫性炎癥，可出現退行性變伴壞死；透明質酸鈉組和華蟾素組可見少量纖維組織增生和部分變性，間質中可見中等量炎癥細胞浸潤，局灶見多核巨細胞反應。華蟾素組與透明質酸鈉組鏡下表現炎細胞和纖維組織增生分布區別不明顯。見圖2。

光鏡下粘連程度比較：假手術組可見到間質細胞間很薄的一層纖維組織，纖維組織間見薄薄的間皮細胞；對照組盲腸腹壁間粘連帶中可見纖維組織增生增厚，間皮細胞增生，炎細胞浸潤明顯；透明質酸鈉組與華蟾素組可見部分粘連組織中少量纖維增生和間皮細胞增生，炎細胞浸潤輕微。透明質酸鈉組與華蟾素組纖維組織和間皮細胞增生較假手術組增生明顯活躍，比對照組增生略輕。見圖3。

3 討論

腸粘連的發生機制目前傾向損傷、炎癥學說。損傷、感染等造成炎癥細胞、間皮細胞、內皮細胞等釋放炎癥介質，造成毛細血管擴張，通透性增高，漿液滲出。刺激釋放凝血活酶，促使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。這些滲出液在術后3h即凝結形成粘連，3d內即自行溶解。若粘連能保持3d或更久而不被吸收，則有成纖維細胞及新生毛細血管長入，形成永久粘連[2，12]。

本實驗發現，與假手術組相比，對照組腹腔內粘連程度比較重，提示腸粘連模型是成功的；與對照組相比，華蟾素組和透明質酸鈉組均能明顯降低組織間粘連，提示華蟾素和透明質酸鈉組在減輕腸粘連方面是有效的，但與假手術組相比腹腔粘連仍較重，二者達不到假手術組的效果，提示其防粘連作用有局限性。華蟾素組與透明質酸鈉組相比，華蟾素組平均秩略好，但二者相比差異無統計學意義。

光鏡下檢查發現，華蟾素組和透明質酸鈉組中炎性細胞浸潤程度和纖維增生程度均較對照組輕，表明華蟾素可減輕急性炎癥反應，這與文獻[7-8]的研究結果是一致的，再次證實華蟾素具有抑制炎癥反應的作用。華蟾素可通過抑制急性炎癥期的炎癥反應，減少炎性滲出，從而抑制纖維組織增生和纖維化形成[13-14]，達到減輕大鼠腹腔內粘連的狀況。

本實驗還觀察到，華蟾素可顯著降低腹腔內TGF-β1含量和血清中TNF-α含量，這與文獻報道是一致的[13，15]，進一步表明，TGF-β1和TNF-α等炎癥介質可能發揮了較為重要的作用[3]。

由此，本實驗結果進一步支持了炎癥損傷學說，提示手術損傷造成炎癥細胞浸潤，釋放TGF-β1和TNF-α等炎癥介質，使毛細血管擴張，通透性增高，漿液滲出。華蟾素通過抑制炎細胞移出、減少損傷組織中炎細胞浸潤程度，從而抑制TGF-β1和TNF-α等炎癥介質的釋放，最終減少膠原纖維蛋白原轉化為膠原纖維蛋白，抑制纖維組織增生，從而達到減輕腸粘連程度的目的。

本實驗還觀察到華蟾素組與透明質酸鈉組相比，TGF-β1和TNF-α炎癥介質水平差異無統計學意義，腹腔內粘連分級差異雖無統計學意義，但平均秩明顯要好一點，提示華蟾素在預防腹腔腸粘連上比透明質酸鈉可能有一定的優勢。分析粘連分級無統計學意義的原因可能是樣本量較少，TGF-β1和TNF-α差異無統計學意義可能與大鼠損傷已度過急性炎癥階段，而取材時間已趨向平緩有關，需要在以后的實驗中進一步驗證。另外，華蟾素屬于水溶性制劑，臨床腹腔沖洗和灌洗等均比透明質酸鈉等藥物方便，臨床上更容易開展使用。

綜上，華蟾素腹腔灌注可以抑制急性炎癥期的炎癥細胞反應和抑制纖維組織增生，從而減輕腹腔腸粘連程度，其機制可能與抑制TGF-β1和TNF-α的過度表達有關。華蟾素屬于水溶性制劑，臨床上更容易開展使用。