基于網絡藥理學分析文癡方治療阿爾茨海默病的作用機制

孔玉鳳 譚浩 肖幸

[關鍵詞]阿爾茨海默病；文癡方；網絡藥理學；槲皮素

阿爾茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是以認知障礙、精神及行為異常和社會功能減退為特征的疾病，是癡呆的最常見病因。根據2019年《世界阿爾茨海默病報告》，預計到2050年全球AD患者人數將增加至15200萬[1]。AD主要表現為認知功能障礙，在中醫上屬于“癡呆”“健忘”等范疇，病位在腦，為本虛標實證，腎虛、髓海虧虛為本，痰濁瘀血閉阻腦絡為標。文癡方是全國第一批名老中醫藥專家胡毓恒在前人的基礎上總結得出的良方，由人參、肉蓯蓉、淫羊藿、三七、何首烏等組成，治以補腎健脾、豁痰祛瘀，具有很好的臨床療效[2]。網絡藥理學是近年來研究中藥治療疾病的有效手段，通過數據庫檢索、數據分析等揭示藥物-基因-靶點-疾病相互作用的網絡關系，本文從網絡藥理學角度探討文癡方治療AD的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 文癡方活性成分及對應靶點篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索文癡方中所有組成藥物的化學成分，設置生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18對化學成分進行篩選，獲得文癡方的活性成分。將有意義的活性成分的InChlKey輸入PubChem數據庫進行搜索，得到標準SMILES結構文件，并將其導入SwissTargetPrediction數據庫，限定物種為“Homosapiens”，獲得活性成分靶點信息，選擇Probability>0.5的預測靶點。將重復值刪除后，最終得到活性成分的靶點。

1.2 疾病靶點獲取

在TherapeuticTargetDatabase（TTD）數據庫和GeneCards數據庫中以“Alzheimer’sdisease”作為關鍵詞對AD相關靶點進行檢索，在GeneCards中設定RelevanceScore≥15為篩選條件，并將兩個數據庫檢索到的疾病靶點合并，去重后獲得AD的疾病相關靶點。

1.3 篩選關鍵靶點

將藥物活性成分作用靶點與AD疾病相關靶點進行韋恩分析，取交集，得到藥物-疾病共同靶點，即為文癡方治療AD的關鍵靶點。

1.4 GO富集和KEGG通路分析

將關鍵靶點輸入DAVID數據庫，進行GO功能富集分析和KEGG分析

1.5 藥物-活性成分-作用靶點-通路-疾病網絡構建

使用Cytoscape3.7.2軟件構建藥物-活性成分-作用靶點-通路-疾病網絡，再利用NetworkAnalyzer功能獲得的度和中介度等參數對模型進行分析。

2 結果

2.1 活性成分和作用靶點預測結果

通過TCMSP數據庫的檢索，并剔除重復值，共獲得文癡方153個活性成分及127個作用靶點。

2.2 疾病相關靶點

在GeneCards數據庫中檢索出9600個疾病靶點，設定RelevanceScore≥15，可篩選出706個疾病相關靶點，在TTD數據庫中檢索出139個疾病相關靶點，去重后共獲得791個AD相關靶點。

2.3 獲得關鍵靶點

將藥物活性靶點及疾病相關靶點進行韋恩分析，共獲得46個關鍵靶點（圖1）。

2.4 GO富集分析

運用DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO富集分析，富集結果設置以P值<0.05進行篩選，共富集到生物學過程208條、分子功能63條、細胞組成45條，分別篩選出前10位使用微生信網站將富集結果進行可視化分析（圖2）。

發現生物過程包括：G蛋白偶聯5-羥色胺受體信號通路、激酶活性的積極調節、蛋白質自磷酸化等；分子功能包括：酶結合、神經遞質受體活性、G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性等；細胞組分包括：樹突、質膜、受體復合物等。

2.5 KEGG通路分析

運用DAVID數據庫對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，富集結果設置以P值<0.05進行篩選，共富集到56條通路，使用微生信網站將富集結果進行可視化（圖3），包括癌癥信號通路、鈣信號通路、AD、PI3K-Akt信號通路等。

2.6 文癡方-活性成分-作用靶點-通路-AD相互作用網絡分析

將文癡方的主要活性成分、潛在作用靶點及信號通路、疾病信息導入Cytoscape3.7.2軟件，建立文癡方-活性成分-作用靶點-通路-AD相互作用網絡（圖4），該網絡中共包含182個節點和463條邊，每條邊代表兩者之間存在相互作用的關系，邊數越多表示該節點的關鍵程度越高。從圖中可以看出，槲皮素度值最大，其次是山柰酚、木犀草素，由此可以認為，文癡方治療AD的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚和木犀草素。同時，在該網絡中，AKT1、EGFR、VEGFA、SRC、MMP9、MMP2、GSK3B、KDR是排名前8的靶點基因，這些靶點可能是文癡方治療AD的關鍵靶點。癌癥信號通路、AD、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路、神經退行性變的信號通路是排名前5的信號通路，提示這些通路可能是文癡方治療AD的關鍵信號通路。由此可見，文癡方可能通過多成分、多靶點、多通路治療AD。

3 討論

《內經精義》云：“事物所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎經。益腎生精化為髓，而藏于腦”，提示腎虛髓海不足會引起癡呆健忘。陳士鐸《石室秘錄》指出“痰氣最盛，呆氣最深”，提示痰濁也是癡呆健忘的致病因素之一。《脾胃論》曰：“上氣不足，腦為之不滿……皆由脾胃先虛，而氣不上行之所致也。”提示脾虛生化乏源，氣不上行可以導致癡呆；同時，脾為生痰之源，脾胃虛弱運化失常致痰濁內生亦可發生癡呆。《傷寒論》有云“其人喜忘者，必有蓄血。所以然者，本有久瘀血，故令喜忘”，提示瘀血也可導致癡呆健忘。因此有人提出[3]，“腎虛髓虧為本，痰瘀阻滯為標”是AD的病機特點。文癡方從其病機入手，補腎健脾、豁痰祛瘀，有中醫理論的支持。

從現代醫學角度，本研究借助網絡藥理學方法對文癡方治療AD進行分析。以上數據表明，AKT1、EGFR、VEGFA、SRC、MMP9、MMP2、GSK3B、KDR是文癡方治療AD的關鍵靶點。PI3K/Akt是一條調節細胞代謝、生存及凋亡的信號傳導通路，神經系統中廣泛存在，在AD發生發展過程中具有重要調控作用。研究證實[4]，AD模型小鼠中，PI3K/Akt通路活性被抑制后β-淀粉樣蛋白（Aβ）大量沉積可導致小鼠學習記憶能力出現障礙。鄭清等[5]通過電針改善AD模型大鼠的學習記憶和認知功能障礙，并推斷其機制可能與調控PI3K/AKT/mTOR信號通路、誘導自噬、促進神經原纖維纏結清除有關。（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）又稱血管內皮生長因子，具有直接營養神經的作用，還可以促進移植和內源性神經前體細胞的增殖、存活和分化，具有潛在的促進腦修復的作用[6]。糖原合酶激酶3β（GSK3B）能夠促進Aβ的沉積和以過度磷酸化Tau蛋白為核心的神經原纖維纏結的形成。一項研究通過生物計算方法整合了大量文獻數據及基因表達數據，數據研究顯示，VEGFA、AKT1、GSK3B與AD的發病息息相關[7]。表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）可參與調節腦發育和神經元的存活與功能調節等活動，被認為是治療β-淀粉樣蛋白誘導的記憶喪失的首選靶點[8]。研究表明，Src基因編碼形成的Src蛋白激酶可能可以促進淀粉樣蛋白依賴性小膠質細胞增生，從而促進炎癥變化及AD的發生發展，抑制Src激酶活性可減輕AD小鼠模型中淀粉樣蛋白相關的小膠質細胞增生，減輕炎癥反應，減緩AD的發展[9]。MMP又稱基質金屬蛋白酶，可通過影響Aβ的代謝、參與Tau低聚物的形成、破壞腦部屏障功能、促進神經炎癥、影響突觸可塑性等改變AD的病理進程[10]。

槲皮素、山柰酚和木犀草素是文癡方治療AD的主要活性成分，三者都屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，可通過減少Aβ的形成、抑制Tau蛋白磷酸化、減少神經細胞凋亡等途徑治療AD[11]。槲皮素具有神經保護作用[12]，可改善AD的學習、記憶和認知功能[13]。據報道，槲皮素可逆轉細胞外β-淀粉樣變性，并減少海馬和杏仁核中的tau蛋白變性、星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生，從而保護三重轉基因AD模型小鼠的AD病理表現和相關認知缺陷[14]。多項研究顯示[15-18]，山柰酚具有神經保護作用，可作為AD的潛在神經保護劑。一項體外實驗研究顯示[19]，木犀草素可能通過激活PI3K/Akt通路，抑制氧化應激及Tau蛋白的磷酸化來實現神經保護作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學，初步探討了文癡方治療AD的潛在機制，通過槲皮素、山柰酚和木犀草素等關鍵成分對核心靶點AKT1、EGFR、VEGFA、SRC、MMP9、MMP2、GSK3B、KDR的調控，最終作用于PI3K-Akt信號通路、AD、癌癥信號通路、鈣信號通路、神經退行性變等相關通路，為文癡方治療AD提供了理論依據。