基于超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討柴芍胃炎顆粒治療慢性胃炎的有效成分及潛在作用機(jī)制

唐定洪 李能源 任維 梁盼 羅群 黃銳 蒲清榮 趙劍 任桂林

[關(guān)鍵詞]柴芍胃炎顆粒；超高效液相色譜-質(zhì)譜；胃炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

慢性胃炎（chronicgastritis，CG）指不同病因引起的各種慢性胃黏膜炎性病變，臨床上以上腹部疼痛、飽脹、燒灼感、反酸噯氣、食欲不振等癥狀多見，是一種常見病，“十人九胃病”，據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計，胃病的發(fā)病率高達(dá)80%，且日趨年輕化，故而胃病已成世界之殤。而CG位居胃病之首，病情反復(fù)，影響患者生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。在我國，基于內(nèi)鏡診斷的CG患病率在90%左右[1]。

胃病的病機(jī)多為胃氣阻滯，胃失和降，不通則痛。若情志不暢，肝郁氣滯，肝胃不和，損傷脾胃，而中焦升降失調(diào)，運化不利，則胃脘部脹痛，故胃病與肝密切相關(guān)[2]。故將CG的病機(jī)概括為肝郁、胃熱、脾虛，治療以疏肝、清熱、補(bǔ)虛為主[3]。柴芍胃炎顆粒是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（我院）醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由柴胡、黃連、吳茱萸、白芍、莪術(shù)、丹參、延胡索、酒大黃、黃芪、木香等中藥制成，其中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，黃連、吳茱萸清肝胃郁熱，木香行氣止痛，延胡索、丹參、酒大黃活血化瘀，黃芪補(bǔ)氣健脾，諸藥共奏疏肝和胃，清熱止痛的功效[4]，用于肝胃不和、肝胃郁熱所致的胃脘脹痛、灼痛噯氣、口干口苦、情志不暢加重等癥[5]。柴芍胃炎顆粒在我院已使用多年，臨床療效顯著，但作用機(jī)制仍不清楚。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接對柴芍胃炎顆粒治療CG的成分及靶點進(jìn)行預(yù)測，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Ultimate3000超高效液相色譜儀，美國Waters公司；LTQOrbitrapvelospro高分辨質(zhì)譜儀，美國ThermoFisher公司。柴芍胃炎顆粒，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號：20211115。

1.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Hss-T3色譜柱（1.8μm，2.1mmID×150mm，Waters）；35℃柱溫；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～5min，2%B；5～8min，2%B→20%B；8～38min，20%B→55%B；38～45min，55%B→70%B；45～50min，70%B→80%B；50～56min，80%B→100%B；56～58min，100%B；58～58.5min，100%B→2%B；58.5～65min，2%B；流速0.2ml/min。質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）離子源，加熱器溫度300℃，毛細(xì)管溫度350℃，毛細(xì)管電壓35V，噴霧電壓為±3.5kV，鞘氣（N2）流速35arb，輔助氣（N2）流速10arb；一級質(zhì)譜正負(fù)離子模式全掃描，m/z掃描范圍100～1500，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴性掃描。

1.3 樣品的制備

取柴芍胃炎顆粒10g，加8倍量的水，超聲30min，過濾，濾液12000r/min離心20min，取上清液，即得供試品。

1.4 柴芍胃炎顆粒活性成分檢索及靶點預(yù)測

檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）獲取柴芍胃炎顆粒中每味中藥的化學(xué)成分，以口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為條件篩選活性成分。在TCMSP中篩選出候選活性成分的靶點信息[6]。將靶點信息導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一基因名稱。

1.5 胃炎相關(guān)靶點的搜集

以“gastritis”“chronicgastritis”“chronicsuperficialgastritis”為檢索關(guān)鍵詞，分別通OMIM（https：//omim.org/），Drugbank（https：//go.drugbank.com/），DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫獲取胃炎的相關(guān)靶點[7]。

1.6 “中藥-有效成分-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將化學(xué)成分的靶點與胃炎疾病的靶點取交集，作為柴芍胃炎顆粒治療胃炎的潛在作用靶點。將化學(xué)成分的靶點與潛在治療靶點相互映射，構(gòu)建“中藥-有效成分-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)[8]，并導(dǎo)入Cytoscape3.8.0進(jìn)行可視化，計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)，篩選重要的化合物及作用靶點。

1.7 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將潛在作用靶點上傳到STRING11.0數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），并將此網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0進(jìn)行可視化，篩選重要的蛋白質(zhì)[9]。

1.8 功能富集分析

應(yīng)用R及Rstudio軟件對柴芍胃炎顆粒治療胃炎的潛在作用靶點的生物過程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、細(xì)胞成分（cellcomponent，CC）和KEGG通路富集分析，運用KEGG數(shù)據(jù)庫（www.kegg.jp）繪制靶點作用通路，進(jìn)一步揭示柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機(jī)制[10]。

1.9 分子對接

通過pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載化學(xué)成分結(jié)構(gòu)（.sdf），PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載靶點的結(jié)構(gòu)。用DiscoveryStudio軟件分別對靶點結(jié)構(gòu)進(jìn)行去除結(jié)晶水、加氫等處理，將PPI中Degree值前10的靶點與“中藥-有效成分-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值前15的化學(xué)成分進(jìn)行對接，以libdockscore值作為對接程度的評判標(biāo)準(zhǔn)。

1.10 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過檢索《中華人民共和國藥典》2020年版[11]，對柴芍胃炎顆粒中的中藥歸經(jīng)進(jìn)行整理，構(gòu)建柴芍胃炎顆粒中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴芍胃炎顆粒主要化學(xué)成分

將柴芍胃炎顆粒供試品按照上述條件進(jìn)行UPLC-HR-MS分析，利用XcaliburQualBrowser軟件及文獻(xiàn)鑒定化合物，圖1為正、負(fù)離子檢測模式下的柴芍胃炎顆粒色譜圖，成分鑒定結(jié)果見表1。

2.2 柴芍胃炎顆粒活性成分及對應(yīng)靶標(biāo)

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫并篩選，得到柴芍胃炎顆粒候選活性化合物249個，其中白芍7個、柴胡11個、大黃6個、丹參54個、黨參13個、莪術(shù)1個、甘草86個、黃連9個、黃芪16個、木香5個、吳茱萸24個、延胡索49個、枳殼5個，共有成分19個。對活性成分進(jìn)行靶點預(yù)測，獲取靶點303個。

2.3 “中藥-有效成分-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)

利用OMIM、Drugbank、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取胃炎的相關(guān)靶點共計2060個。將成分靶點與疾病靶點取交集，共有134個交集靶點。將上述結(jié)果構(gòu)建“中藥-有效成分-治療靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中共有396個節(jié)點（中藥13個、成分249個、靶點134個），其中菱形代表治療靶點，上方圓形的代表共有化學(xué)成分，其余則代表中藥及各自中藥的化學(xué)成分。對節(jié)點拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的節(jié)點，Degree值在前10位的化合物分別是：槲皮素、木樨草素、山柰酚、川陳皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芒柄花黃素、異鼠李素、甘草查爾酮A、丹參酮ⅡA，這些成分作用于胃炎的潛在靶點較多，說明這些成分與胃炎的靶點關(guān)系密切。Degree值在前10位的靶點分別是：PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、AR、NOS2、PPARG、CHRM3、ESR2、F2、GSK3B，說明柴芍胃炎顆粒治療胃炎與這幾個靶點相關(guān)性較大。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將134個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白質(zhì)間的相互作用信息，除了COA7靶點，其余靶點均具有相互作用。其Degree值較高的靶點為AKT1、IL6、TNF、TP53、IL1B、CASP3、JUN、PTGS2、MMP9、STAT3，其值分別為104、104、102、99、95、92、92、88、87、87。見圖3。

2.5 靶點富集通路分析

由GO富集分析結(jié)果可知，柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用靶點主要涉及的生物過程包括對脂多糖的反應(yīng)，對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)，活性氧代謝過程和對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。分子功能主要包括細(xì)胞因子活性，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細(xì)胞組分主要涉及膜筏，膜微區(qū)等結(jié)果見圖4。KEGG富集分析P值最小的通路為脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路，見圖5，在該通路中，淺色靶點代表該通路中最為關(guān)鍵的靶點。

2.6 分子對接

運用DiscoveryStudio軟件對靶點和化學(xué)成分進(jìn)行分子對接，篩選對接分?jǐn)?shù)值最高的靶點和其對應(yīng)的化學(xué)成分，木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚等化學(xué)成分與靶點對接值較高，靶點中PTGS2、CAPS3等靶點對接分?jǐn)?shù)值最高，其中PTGS2與木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚對接分?jǐn)?shù)值達(dá)到了130，分子對接圖見圖6，表明這幾個分子具有的潛在作用活性強(qiáng)。

2.7 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分析

中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖中有11味中藥均歸脾經(jīng)，有8味中藥歸肝經(jīng)，有6味中藥歸胃經(jīng)，可見柴芍胃炎顆粒的主要作用部位在脾、肝、胃，這與柴芍胃炎顆粒的功效主治一致，見圖7。

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，初步探討了柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機(jī)制。分子對接的結(jié)果表明PTGS2與木犀草素、吳茱萸次堿、山柰酚對接分?jǐn)?shù)值較高，起主要作用。PTGS2、PTGS1又分別名為COX-1、COX-2，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素代謝中的關(guān)鍵酶。PTGS1參與前列腺素的成分生成，特別是在胃和血小板中，是胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素和血小板產(chǎn)生血栓素A2（TXA2）的關(guān)鍵步驟。PTGS2在平滑肌及絕大多數(shù)被生長因子、細(xì)胞因子或激素刺激的組織中表達(dá)，負(fù)責(zé)產(chǎn)生炎癥性前列腺素，參與細(xì)胞生長、PG的產(chǎn)生等生物過程。通過降低PTGS2的表達(dá)起到抗炎作用[16]。因此，柴芍胃炎顆粒治療胃炎的靶點主要與抗炎、細(xì)胞增生等機(jī)制相關(guān)。

本研究運用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，對柴芍胃炎顆粒的多成分-多靶點的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行探究，初步闡釋了柴芍胃炎顆粒治療胃炎的作用機(jī)制，為探索藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了方向。