市售酶抑制-比色法農殘速測試劑盒對多種農藥敏感性的研究

河南省農產品質量安全檢測中心 喬禮

鄭州市農產品質量檢測流通中心 羅俊霞

酶抑制法農藥殘留快速檢測試劑盒是基于有機磷和氨基甲酸酯類農藥對動物體內膽堿酯酶的抑制作用研制的。進行檢測時，在膽堿酯酶及其底物（乙酰膽堿）的共存體系中加入農產品樣品提取液，當樣品中含有不同濃度的有機磷或氨基甲酸酯類農藥時，酶活性受到不同程度抑制，乙酰膽堿被酶催化水解的程度發生變化，水解產物與加入的顯色劑的變色反應亦隨之發生變化；反之，如果試樣提取液中未含有該兩類農藥，酶的活性不被抑制，試樣中加入的底物被酶催化水解，其產物與加入的顯色劑反應的變色程度較大。目測顏色的變化或用分光光度計測定吸光度在一定時間內的變化值，計算出抑制率，可以粗略判斷樣品中是否含有該兩類農藥殘留。該方法的核心試劑是酶，而酶來源廣泛，不同來源及來源于同一生物體不同部位的酶活性均不相同，對農藥的敏感性也存在較大差異，由此衍生出的兩種快速檢測試劑盒對農藥的敏感性也各不相同，因此在日常檢測工作中應用該方法的檢測結果同樣品實際時常不符，出現假陽性或假陰性的結果。為了全面了解市售酶抑制-比色法農藥殘留快速檢測試劑盒的品質，使其在農產品檢測與監管工作中發揮更大作用，特安排本試驗，以期為使用者提供一定的借鑒作用。

一、材料與方法

（一）試驗儀器

上海復博農業科技有限公司、上海博納新技術研究所生產的16 通道、CL-BIII 型農殘速測儀；杰瑞爾電器有限公司生產的SHA-C 型、雙重恒溫水浴振蕩器；WH-861 型旋渦混合器；北京三二八科學儀器有限公司生產的HH.W21-Cr 420 型電熱恒溫水浴鍋；Thermo 品牌的200μL 和Rongtai 品牌的 5 mL 移液槍。

（二）試劑及其配制方法

1. 產自深圳的永道品牌的酶抑制-比色法農藥殘留快速檢測試劑盒；試驗用水為純凈水；使用前，采用500 mL 的純凈水溶解緩沖鹽得到緩沖溶液；使用3 mL的緩沖溶液配制酶和顯色劑；使用3 mL 的純凈水配制底物。

2.農藥標準品。辛硫磷、喹硫磷、敵敵畏、氧化樂果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲、伏殺硫磷、蠅毒磷、水胺硫磷、倍硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷22 種有機磷類農藥和涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威砜5 種氨基甲酸酯類農藥。

農藥標準品濃度為1000 mg·L-1，來源于農業環境保護科研檢測所，使用時先稀釋成80 μg· mL-1的儲備液，試驗時按照需要進行吸取。

（三）試驗設計

試驗分別取適量農藥標準品于一次性燒杯中，按照2 g 稱樣量，使農藥的質量濃度分別為0.05 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、3 mg·kg-1，每 一種農藥設5 個濃度梯度；每個濃度水平3 次重復。

1.測試方法。對照液和農藥測試：對照液和農藥的測試方法參照國標進行；設定2.5 mL 和3 mL 兩種樣品提取體積。分別移取2.5 mL 和3 mL 的緩沖溶液和樣品提取液于10 mL 一次性試管中，再依次加入100μL 酶、100μL 顯色劑，旋渦混勻，在37℃條件下水浴10 min，之后加入100μL 底物搖勻，將對照液和樣品同時放入16 通道的CL-BIII 型農殘速測儀比色池中進行檢測（對照液放第一通道）；儀器根據第一通道測定的對照3 min內吸光度的變化值自動計算得到抑制率，記錄抑制率。

2.數據處理。選取5 種農藥在各濃度水平下3 次測定所得抑制率的加權平均值在0～100%的濃度值，用Excel 將抑制率和農藥濃度常用對數的散點圖進行線性擬合，得到濃度-效應曲線方程、求出相關系數及每一種農藥對各種試劑盒的半抑制濃度IC50。根據濃度-效應曲線方程y=kx+b求得y=50%時對應的x軸的值，IC50=10x；線性范圍是指抑制率為0 對應最大的濃度值到測定的最大的抑制率對應的濃度值之間的范圍；同樣求出IC10。

因食品安全國家標準中規定新鮮蔬菜中毒死蜱、甲基對硫磷、氧化樂果的最大限量分別為0.05 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1，個別試劑盒測定這3 種農藥的IC50的最大值分別為6.70 mg·kg-1、9.924 mg·kg-1、10.397 mg·kg-1，其對應的IC10的值分別為0.940 mg·kg-1、1.620 mg·kg-1、2.781 mg·kg-1，均大于國家的限量標準，因此，本試驗將IC10設定為試劑盒的檢測限，以此比較不同的試劑盒對不同農藥的敏感性；IC10越低，說明試劑盒對該農藥越敏感。當IC10＜10-3mg·kg-1，試劑盒對農藥極敏感；當10-3mg·kg-1＜ IC10＜ 10-1mg·kg-1，試劑盒對農藥較敏感；當10-1mg·kg-1＜IC10＜1 mg·kg-1，試劑盒對農藥不太敏感；當IC10≥1 mg·kg-1，試劑盒對農藥不敏感。

通過試驗的結果比較2.5 mL 和3 mL 的樣品提取體積對測定結果的影響和該試劑盒對不同的有機磷農藥的敏感性。

二、結果與分析

經過測定，試劑盒測定蠅毒磷和甲基異柳磷，當提取液取用3 mL 時，抑制率同農藥濃度之間不存在線性關系，當提取液取用2.5 mL 時，在農藥5 個濃度水平下，抑制率均為0。無論樣品提取液取用3 mL 還是2.5 mL，測定水胺硫磷和倍硫磷，抑制率同農藥濃度之間不存在線性關系；伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷7 種農藥，在5 個濃度水平下，抑制率均為0。也就是說該試劑盒對蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷11 種農藥極不敏感。

（一）取用3 mL 樣品提取液試驗

由表1 知，當提取液取用3 mL 時，試劑盒對16 種農藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、辛硫磷、涕滅威、喹硫磷、涕滅威砜、敵敵畏、氧化樂果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲的順序依次降低。試劑盒對涕滅威亞砜、克百威農藥極為敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所測試農藥總數的7.41 %；試劑盒對滅多威、辛硫磷、涕滅威、喹硫磷4 種農藥較為敏感，其IC10均在10-3～10-1mg·kg-1，占所測試農藥總數的14.81%；試劑盒對涕滅威砜、敵敵畏、氧化樂果3 種農藥不太敏感，其IC10在 10-1～1 mg·kg-1，占所測試農藥總數的11.11%；試劑盒對毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲極不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所測試農藥總數的25.93%，總體上講，試劑盒極不敏感的農藥占所測試農藥的66.67%。

表1 提取液取用3 mL 時試劑盒對16 種農藥的敏感性對照

（二）取用2.5 mL 樣品提取液試驗

由表2 可知，當提取液取用2.5 mL 時，試劑盒對16 種農藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、喹硫磷、涕滅威砜、敵敵畏、辛硫磷、氧化樂果、久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏殺硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲、殺撲磷的順序依次降低。試劑盒對涕滅威亞砜、克百威農藥極為敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所測試農藥總數的7.41 %；試劑盒對滅多威、涕滅威、喹硫磷3 種農藥較為敏感，其IC10均在 10-3～10-1mg·kg-1，占所測試農藥總數的11.11%；試劑盒對涕滅威砜、敵敵畏、辛硫磷、氧化樂果4 種農藥不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所測試農藥總數的14.81%；試劑盒對久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏殺硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲、殺撲磷極不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所測試農藥總數的29.63%，總體上講，試劑盒極不敏感的農藥占所測試農藥的66.67%

表2 提取液取用2.5 mL 時試劑盒對16 種農藥的敏感性對照

三、結論與討論

從IC10看，在所測試的27 種農藥中，試劑盒對蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷11種農藥極不敏感，測定時樣品提取液無論是取用3 mL還是2.5 mL，在設定的5 個農藥濃度水平下，抑制率 為0或者抑制率同農藥濃度之間無線性關系。在用該試劑 盒測定實際樣品時，當樣品中含有這11 種農藥中的任意一種或者幾種（在食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量中規定的限量以上、在3 mg·kg-1以下），用該試劑盒測定將出現假陰性；當樣品中含有涕滅威亞砜，其含量大于2.041 7×10-4mg·kg-1、小于食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量中規定的限量時，用該試劑盒測定將出現假陽性。因此，試劑盒對各農藥敏感性的巨大差異是導致試劑盒檢測樣品出現假陽性和假陰性的原因之一。

根據《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》的規定，采用永道試劑盒進行檢測，按照50%的判定閾值進行判定，在所測定的27 種農藥中，只有當樣品中含有涕滅威砜、克百威時可以報出陽性，含有其他25種農藥均只能報出陰性，因此，建議國標和行標修改判定閾值。