上海地區促生長抗菌藥物對豬、雞源糞腸球菌最小抑菌濃度分布變遷分析

摘要：目的 了解上海地區豬、雞源糞腸球菌的最小抑菌濃度（MIC）在促生長抗菌藥物（AGPs）禁用前后的分布變遷情況。方法 收集2018—2021年上海地區豬、雞源糞腸球菌391株，采用微量肉湯稀釋法測定桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、恩拉霉素等4種促生長藥物的MIC，結合動物種類、藥物使用狀況等信息綜合分析MIC的分布變遷情況。結果 糞腸球菌對黃霉素敏感，MIC集中在1～4 μg/mL，對吉他霉素最為耐受，超50%菌株MIC大于512 μg/mL；2018—2021年間，黃霉素、吉他霉素和桿菌肽的MIC有降低趨勢，恩拉霉素MIC呈上升趨勢；吉他霉素等3種抗菌藥物對雞源糞腸球菌的MIC顯著高于豬源菌株。結論 禁止獸用促生長抗菌藥物的大背景下，上海地區豬、雞源糞腸球菌趨于敏感，但也存在如黃霉素MIC上升的情況，因此仍需對促生長抗菌藥物的MIC進行監測以獲得全面持續的數據，為后續政策提供依據。

關鍵詞：促生長抗菌藥物；最小抑菌濃度；動物源糞腸球菌；分布變遷；上海；抗生素

中圖分類號：R978" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2023）02-0113-05

Analysis of the Distribution and Variation Trends of the Minimum Inhibitory Concentration of Antimicrobial Growth Promoters against Enterococcus faecalis from Swines and Chickens in Shanghai

Jiang Qin，" nbsp;Zhang Yu，" "Sun Bing-qing，" "Gu Xin，" "Wu Yu-shan，" "Zhang Wen-gang

（Shanghai Institute for Veterinary Drug amp; Feeds control，" Shanghai" "201103）

Abstract： Objective In order to know the distribution and variation trends of the minimum inhibitory concentration （MIC） of antimicrobial growth promoters （AGPs） against Enterococcus faecalis from swines and chickens in Shanghai during the implementation of the policy of prohibiting the use of AGPs. Methods 391 strains of Enterococcus faecalis from swines and chickens in Shanghai from 2018 to 2021 were collected. Miro broth dilution method was done to test the MIC values of bacitracin， kitasamycin， enramycin and flavomycin. The variation of MIC distribution and its correlation with animal species and drug use were comprehensively analyzed. Results Enterococcus faecalis was most sensitive to flavonycline， with a MIC concentration of 1～4 μg/mL and the most tolerant to kitasamycin， with a MIC over 512 μg/mL for more than 50% strains. From 2018 to 2021， there was a decline of MIC values in flavomycin， kitasamycin and bacitracin， and the MIC values of enramycin showed an increasing trend. The MIC values of three AGPs such as kitasamycin against Enterococcus faecalis from chicken was significantly higher than that against strains from swine. Conclusion Against the background of prohibiting the use of AGPs， Enterococcus faecalis from swines and chickens in Shanghai trended to be sensitive， while there was still an increase in MIC of flavomycin. Therefore， the MIC of AGPs still needs to be surveyed and mornitored to gain comprehensive and continuous data for policy implementation.

Key words： AGPs;" "MIC;" "Enterococcus faecalis from animal;" "distribution and variation trend;" "Shanghai; antibiotic

自1946年抗菌藥物首次被發現具有預防疾病、促進畜禽增重等功效以來，促生長抗菌藥物（Antimicrobial growth promoters，AGPs）被廣泛應用在畜禽養殖業，為行業的迅速發展做出了積極貢獻。但是，抗菌藥物亞治療劑量的長期使用及畜禽養殖過程中的不合理用藥等因素極易造成細菌耐藥和藥物殘留等問題，對人和動物的健康及生態環境造成潛在威脅 [1-3]。

2006年，歐盟全面禁止促生長抗菌藥物的使用。美國也先后取消了青霉素、四環素等在農業中的用途。我國對于促生長抗菌藥物使用的限制較晚。2016年，農業部公告第2428號決定停止硫酸黏菌素用于動物促生長；2018年，《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案（2018—2021年）》實施；2019年，農業農村部公告第194號規定“退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑”。至此，促生長抗菌藥物在我國正式全面禁用。

1970年起，國際上就開始了促生長抗菌藥物耐藥性的相關研究[4]，但隨著國外促生長藥物的逐步退出，相關研究趨于減少，而國內關于促生長抗菌藥物的研究又多集中在殘留和藥物的檢測分析上[5-6]，僅有小部分促生長藥物耐藥性和功效的研究，且時間也較為久遠[7-9]。隨著抗菌藥物促生長功能在國內的全面禁用，相關細菌耐藥性實際變化情況，政策實施效果的后評價等均需要對該類藥物的耐藥性進行監測分析。同時，國際上仍有國家允許將部分抗菌藥物做促生長用。因此在細菌耐藥全球化的今天，及時掌握該類藥物的耐藥現狀和變遷趨勢具有重要意義。

2020年前，我國允許作為促生長使用的抗菌藥物有11種，包括桿菌肽鋅預混劑、黃霉素預混劑和維吉尼亞霉素預混劑等。結合我國促生長抗菌藥物實際使用情況及藥物分類，本研究選擇桿菌肽、吉他霉素、恩拉霉素和黃霉素作為測定對象。該4種藥物主要作用于革蘭陽性菌，而世界動物衛生組織（OIE）發布的國家耐藥性監測方案中將腸球菌（糞腸球菌、屎腸球菌）作為革蘭陽性菌的共生菌指示菌[10]。

結合上海地區腸球菌實際分離情況，本研究收集2018—2021年間上海地區391株豬、雞源糞腸球菌，并測定桿菌肽、吉他霉素、恩拉霉素和黃霉素4種促生長抗菌藥物對菌株的最低抑菌濃度（MIC），綜合用藥情況分析政策實施前后細菌耐藥變化趨勢，為掌握用藥與耐藥性關系及相關政策制定提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2018—2021年間上海地區15家規模養殖場（豬場8家、雞場7家）健康豬肛拭子、雞泄殖腔拭子（由于退養政策，部分養殖場未能連續4年采樣，其中5家連續采樣3年，2家連續采樣2年，2家采樣1年，其余6家連續采樣4年）。經顯色培養基分離，VITEK生化鑒定得391株糞腸球菌，其中豬源161株，雞源230株；2018年80株，2019年140株，2018年79株，2019年92株。質控菌株為糞腸球菌ATCC 29212。所有菌株采用瓷珠保菌法凍存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 藥敏檢測板

凍干型96孔藥敏檢測板[復興診斷科技（上海）有限公司]內含4種等倍梯度稀釋的促生長抗菌藥物。藥物種類根據《中國獸用抗菌藥使用情況報告》（2018—2020年）及上海地區獸用抗菌藥物實際使用情況選擇，具體藥物及測定濃度見表1。

1.1.3 主要儀器和試劑

全自動菌液接種儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）（青島海博生物技術有限公司），陽離子調節MH肉湯（CAMHB）[復興診斷科技（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 菌液接種

參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）發布的M31文件中藥敏測定步驟。將待測菌株和糞腸球菌標準菌株ATCC 29212劃線接種至TSA平板上，35 ℃培養18 h；用無菌棉簽挑取適量新鮮培養的單菌落，置0.9%無菌生理鹽水中，混勻，調節菌液濃度約為0.5麥氏單位；取菌液60 μL，加入12 mL無菌CAMHB中，混勻即得菌液稀釋液；將菌液稀釋液按每孔100 μL接種至藥敏檢測板中，同時陰性對照孔加入100 μL無菌CAMHB，陽性對照孔加入100 μL菌液稀釋液。35 ℃培養18 h。

1.2.2 結果判讀

當陰性對照孔內無細菌生長，陽性對照孔內細菌生長，則該藥敏板試驗結果有效。藥物完全抑制細菌生長（即孔內無渾濁或菌斑）的最低濃度為該藥物對細菌的MIC，讀取并記錄。當糞腸球菌標準菌株ATCC 29212的MIC值在質控范圍內時，則該批次藥敏試驗結果有效。讀取待測菌株MIC值。糞腸球菌標準菌株的質控范圍見表2。

1.2.3 MIC均值計算

在分析細菌耐藥性情況時，常通過耐藥折點判斷細菌對抗菌藥物的敏感、耐藥等情況，目前我國主要采用CLSI和歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）的折點判斷標準，但由于促生長抗菌藥物在歐美國家退出較早，因此兩者對于促生長抗菌藥物的折點均無相應標準。我國雖然2020年才全面停止促生長抗菌藥物的使用，但對于該類藥物的耐藥性研究較少，也未制定相應標準，因此研究主要通過計算每年MIC均值探索細菌對抗菌藥物的敏感性變遷情況。參考縱帥等[11]的研究，將藥物每年MIC分布百分比乘以對應MIC濃度，并求和即得不同藥物每年的MIC均值。

2 結果

2.1 MIC分布特征

2018—2021年間，4種促生長抗菌藥物對糞腸球菌MIC測定結果顯示，上海地區動物源糞腸球菌對黃霉素的MIC分布范圍最低，主要集中在1～4 μg/mL內，對吉他霉素的MIC分布范圍最高，大部分高于 512 μg/mL。不同年份MIC分布不盡一致，其中2019年MIC分布范圍較廣，數據較為分散，其他年份MIC分布范圍相對集中。詳見表3～表6。

2.2 MIC均值變遷

結果顯示，2018—2021年間，黃霉素、吉他霉素和桿菌肽MIC均值整體呈下降趨勢，其中黃霉素自2019年以來連年下降，降幅較大，而桿菌肽2018—2020年間連年下降，但2021年有顯著上升；恩拉霉素自2018年以來，MIC均值呈波浪上升趨勢。詳見圖1（圖中虛線為線性趨勢線）。

2.3 不同動物MIC均值比較

2018—2021年共有豬源糞腸球菌161株，雞源糞腸球菌230株。分別計算4種促生長抗菌藥物4年間對豬、雞源糞腸球菌的MIC均值可知，豬、雞源糞腸球菌均對黃霉素最敏感，MIC均值范圍最低，對吉他霉素最耐受，MIC均值范圍最高；桿菌肽和恩拉霉素對雞源菌株的MIC均值顯著高于豬源菌株且MIC走勢基本一致，而黃霉素對豬源菌株的MIC均值則遠高于雞源菌株且雞源菌株MIC均值在低濃度較為平穩，而豬源糞菌株MIC在4年間變化較大，2018—2020年上升顯著，2021年下降顯著；吉他霉素對雞源菌株MIC平穩中略有下降，整體高于豬源菌株MIC，但吉他霉素對豬源菌株MIC自2019年以來連年上升，且在2021年MIC超過雞源菌株。詳見圖2。

3 討論

3.1 MIC變遷與抗菌藥物使用

根據報道[12-14]，2018—2020年間，我國獸用抗菌藥物使用量呈小幅上升趨勢，但在政策支持下，促生長抗菌藥物使用量則由15 413萬噸下降到9 403萬噸，降幅顯著。2018—2020年間，本文研究的4種藥物使用量呈先上升再下降的趨勢（詳見表7）。結合MIC變遷分析，2018—2021年間，吉他霉素和黃霉素使用量顯著下降，MIC均值也呈下降趨勢；桿菌肽在4種藥物中使用量最高，且2020年使用量仍高于2018年，雖然2021年MIC均值略低于2018年，但較2019年有顯著上升；恩拉霉素使用量下降明顯，但MIC均值有上升趨勢。綜合而言，吉他霉素、黃霉素和桿菌肽3種藥物的使用量和MIC變遷相對較為匹配，恩拉霉素的使用量情況和MIC變遷趨勢相差較大。針對這一情況，可能需要更長時間的監測同時對藥物使用情況進行更深入的調查。但是由于僅可收集到全國促生長抗菌藥物使用數據，因此本研究對MIC和用藥情況的分析可能存在一定偏差。

3.2 MIC均值與動物種類

本文研究的4種促生長抗菌藥物均可用于豬、雞。結合4年間所有菌株的MIC均值可知，恩拉霉素、桿菌肽和吉他霉素對雞源糞腸球菌的MIC高于豬源菌株，而黃霉素則對豬源菌株MIC更高，豬源菌株整體對促生長抗菌藥物更加敏感，這與2018年以來我國許多地區的治療用抗菌藥物的情況一致[15-17]。而在2018年之前，豬源菌株耐藥率總體高于雞源菌株的報道更多[18-19]。該現象可能與非洲豬瘟疫情、抗菌藥物減量化行動、上海市養殖業布局規劃等綜合因素有關，上海地區生豬養殖產業整體趨向規范、科學，在抗菌藥物使用及生態環境控制等方面有較高提升，因此豬源細菌耐藥性有好轉[20]。

本研究分析了2018—2021年間，上海地區4種促生長抗菌藥物對豬、雞源糞腸球菌MIC的變遷情況。結果表明在2018年抗菌藥物減量化行動，2020年促生長抗菌藥物全面禁用等政策的實施下，上海地區動物源糞腸球菌菌株整體趨向敏感，但仍存在黃霉素MIC均值4年間呈上升趨勢，桿菌肽和恩拉霉素MIC均值在2021年有顯著上升等情況。這表明政策實施對遏制細菌耐藥具有一定積極作用，但對于部分藥物MIC不降反升的情況，則應在繼續監測分析的同時保證政策的持續實施，以達到有效遏制細菌耐藥的目的。

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