南寧地區某院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型與基因型檢測

摘要：目的 了解南寧地區某院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐藥性及碳青霉烯酶產生情況，為CRKP感染防控提供依據。方法 收集2021年1月至2022年2月臨床分離的CRKP共46株，用Phoenix M50全自動微生物鑒定藥敏分析儀進行藥敏試驗，采用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗進行碳青霉烯酶表型篩選，用PCR擴增碳青霉烯酶耐藥基因。結果 46株CRKP對厄他培南100%耐藥，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為76.1%和78.3%，對除氨曲南外的其他β-內酰胺類藥物的耐藥率均為100%，對替加環素耐藥率為0，對多黏菌素B（4.3%）及阿米卡星（32.6%）耐藥率較低；碳青霉烯酶表型篩選試驗檢出單產A類碳青霉烯酶菌株33株（71.7%），單產B類金屬β-內酰胺酶9株（19.6%），單產D類OXA-48型碳青霉烯酶2株（4.3%），同時產A類和B類碳青霉烯酶2株（4.3%）；46株CRKP均檢出碳青霉烯酶耐藥基因，其中，33株（71.7%）僅攜帶KPC-2基因，7株（15.2%） 僅攜帶NDM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶VIM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶OXA-48基因，2株（4.3%）同時攜帶KPC-2和NDM-1基因，未檢出IMP型。結論 某院分離的CRKP對常見抗菌藥物具有高度耐藥性，主要產KPC-2型碳青霉烯酶，應加強抗菌藥物合理使用、CRKP酶型檢測與感染控制，有效防范院內感染。

關鍵詞：碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐藥性；碳青霉烯酶表型；碳青霉烯酶基因型；碳青霉烯酶抑制劑增強試驗

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2023）02-0118-05

Detection of Carbapenemase Phenotype and Genotype of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in a Hospital of Nanning

Hu Qiao-juan1，Liang Liang2，Chen Xing-chun2，Zhao Li2，Li Jia-qing2

（1 Guangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Nanning" "530003;"2 The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，" "Nanning" "530016）

Abstract： Objective To investigate the drug resistance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP） and the production of carbapenemase in a hospital of Nanning and provide evidence for the prevention and control of CRKP infection. Methods A total of 46 strains of CRKP were collected from January 2021 to February 2022. Antimicrobial susceptibility test of CRKP strains was detected by Phoenix M50 automatic microbial identification and drug sensitivity analyzer， and carbapenemase inhibitor enhancement method was used to detect carbapenemase phenotype. Polymerase chain reaction（PCR） was used to amplify the carbapenemase-encoding drug resistance genes. Results The 46 strains of CRKP were 100% resistant to ertapenem， 76.1% resistant to imipenem and 78.3% resistant to meropenem， respectively. Except for aztreonam， the strains were 100% resistant to β-lactam antibiotics. The resistance rate to tigecycline was 0， and the resistance rate to polycolistin B （4.3%） and amikacin （32.6%） was low. Carbapenemase resistance gene was detected in 46 CRKP strains， of which 33 strains （71.7%） only carried KPC-2 gene， 7 strains （15.2%）" carried NDM-1 gene， 2 strains （4.3%） carried VIM-1 gene， and 2 strains （4.3%） carried OXA-48 gene. Two strains （4.3%） carried both KPC-2 and NDM-1 genes， while IMP genotype was not detected. Carbapenemase resistance gene was detected in 46 CRKP strains， of which 33 strains （71.7%） only carried KPC-2 gene， 7 strains （15.2%）" carried NDM-1 gene， 2 strains （4.3%） carried VIM-1 gene， and 2 strains （4.3%）" carried OXA-48 gene. Two strains （4.3%） carried both KPC-2 and NDM-1 genes， while IMP genotype was not detected.. Conclusion CRKP isolated from a hospital is highly resistant to the common antibacterial drugs and mainly produces KPC-2 carbapenemase. The rational use of antibiotics， detection of CRKP enzyme type and infection control should be strengthened to effectively prevent nosocomial infection.

Key words： carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae;" "carbapenemase;" "drug resistance;" "carbapenemase phenotype;" "carbapenemase genotype;" "carbapenemase inhibition enhancement test

近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriales，CRE），尤其是肺炎克雷伯菌的分離率呈快速上升趨勢，嚴重威脅著患者的健康和醫療安全，是全球面臨的嚴峻公共衛生問題[1]。產生KPC型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的最主要機制[2]。碳青霉烯酶包括Ambler A類、B類和D類，A類最常見，為絲氨酸碳青霉烯酶，以KPC為主；B類為金屬β-內酰胺酶，以NDM、IMP、VIM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶，以OXA-181和OXA-232為主[3]。本文旨在通過檢測廣西壯族自治區人民醫院近期收集的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）碳青霉烯酶耐藥表型及基因型，以期為臨床精準抗感染治療及感染防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2021年1月至2022年2月廣西壯族自治區人民醫院臨床分離的CRKP菌株（對亞胺培南、美羅培南或厄他培南任一藥物耐藥菌株），共計46株，剔除同一患者同一部位來源的重復菌株。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853（廣西壯族自治區臨床檢驗中心贈送）；碳青霉烯酶表型篩選質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706（美國BD公司惠贈）。

1.2 儀器與試劑

Phoenix M50全自動微生物鑒定藥敏分析儀（美國BD公司），飛行質譜儀microflex LT/SH（德國布魯克公司），PCR擴增儀（上海宏石公司），麥氏比濁儀（美國BD公司），高速冷凍離心機（上海力辰公司），水平電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠成像分析系統（廣州譽維公司）；藥敏紙片亞胺培南（IPM）、美羅培南（MEM）、厄他培南（ETP）與MH培養基（英國OXIOD公司），空白藥敏紙片（湖南比克曼生物公司），多黏菌素B藥敏試劑（微量肉湯稀釋法）（溫州市康泰生物公司），2×San Taq PCR Mix預混液、DNA Marker、引物合成（上海生工生物公司），瓊脂糖（西班牙Biowest公司），二甲亞砜（天津科密歐公司），3-氨基苯硼酸（APB）（上海麥克林公司），乙二胺四乙酸（EDTA）（天津致遠化學試劑公司）。

1.3 細菌鑒定與藥敏試驗

采用布魯克MALDI Biotyper質譜儀進行細菌鑒定，Phoenix M50全自動微生物鑒定藥敏分析儀進行藥敏試驗，對多黏菌素B中介或耐藥菌株采用微量肉湯稀釋法復核其最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。藥敏結果判斷標準采用美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2021年版文件判斷[4]，頭孢哌酮/舒巴坦藥敏結果判斷參照腸桿菌目細菌的頭孢哌酮折點判斷標準。替加環素判斷標準參照美國食品和藥品監督管理局（FDA）推薦的折點標準（MIC≤2 μg/mL敏感，MIC≥8 μg/mL耐藥）。耐藥數據統計分析使用WHONET 5.6軟件。

1.4 碳青霉烯酶表型篩選

1.4.1 A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內酰胺酶檢測

采用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗進行檢測（APB-EDTA法）。使用滅菌去離子水配制0.1 mol/L的EDTA溶液，用二甲亞砜配制30 mg/mL的APB溶液備用。實驗步驟參照文獻[3]進行：參照CLSI推薦的紙片擴散法，將待測菌調制成0.5麥氏濁度菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂平板上。隨后貼4張相同的碳青霉烯類抗菌藥物紙片（亞胺培南/美羅培南/厄他培南）于瓊脂表面。1張紙片不加任何液體，1張紙片滴加APB溶液10 μL，1張紙片滴加EDTA溶液10 μL，最后1張紙片同時滴加APB溶液和EDTA溶液各10 μL，過夜培養后量取紙片抑菌圈直徑。結果判讀如下：（1）添加APB溶液的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷待測菌產A類碳青霉烯酶；（2）添加EDTA溶液的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷待測菌產B類碳青霉烯酶；（3）如僅同時添加APB和EDTA的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，可判斷該待測菌同時產A類和B類碳青霉烯酶；（4）如含酶抑制劑的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥相差均＜5 mm，可判斷該菌不產A類或B類碳青霉烯酶。

1.4.2 D類OXA-48型碳青霉烯酶檢測

對不產A類或B類碳青霉烯酶的菌株同樣采用APB-EDTA法檢測OXA-48型碳青霉烯酶。使用滅菌去離子水配制0.1 mol/L的EDTA溶液，用二甲亞砜配制60 mg/mL的APB溶液備用。實驗步驟參照文獻[5]進行：參照CLSI推薦的紙片擴散法，將大腸埃希菌ATCC 25922調制成0.5麥氏濁度菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂平板上。將1張亞胺培南紙片貼于瓊脂表面，取2張無菌空白紙片，每張紙片取待測菌純分菌落3～4個，在亞胺培南左右各貼上1張已取待測菌的空白藥敏紙片。然后在亞胺培南紙片左邊的空白紙片加EDTA溶液10 μL，在亞胺培南紙片右邊的空白紙片同時加EDTA溶液和APB溶液各10 μL。過夜孵育后判讀結果：（1）含EDTA或APB空白紙片均出現細菌矢狀生長者，提示該菌產OXA-48型碳青霉烯酶；（2）含EDTA或APB空白紙片均未出現細菌矢狀生長者，提示該菌產B類碳青霉烯酶；（3）僅含EDTA空白紙片出現細菌矢狀生長者，提示該菌產A類碳青霉烯酶。

1.5 碳青霉烯酶基因檢測

采用加熱煮沸法提取細菌 DNA 模板，PCR擴增5種常見的CRKP耐藥基因，引物參照文獻[6]設計，見表1。PCR反應體系為25 μL：2×San Taq PCR Mix預混液12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共36個循環，最后 72 ℃延伸5 min。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果并拍照。將部分擴增產物送上海生工生物公司進行純化和雙向測序后與GenBank數據庫進行比對，確定CRKP菌株攜帶的碳青霉烯酶基因型。

2 結果

2.1 標本來源

46株CRKP分離自下呼吸道27株（58.7%）、尿液6株（13.0%）、血液5株（10.9%）、腹水3株（6.5%）、膿液2株（4.3%）、其他標本3株（6.6%）。

2.2 科室分布

重癥醫學科32株（69.6%）、呼吸內科4株（8.7%）、移植科4株（8.7%）、急診科2株（4.3%）、康復科1株（2.2%）、胃腸外科1株（2.2%）、消化內科1株（2.2%）、心血管內科1株（2.2%）。

2.3 CRKP對常用抗菌藥物的耐藥率

46株CRKP對常用抗菌藥物有較高的耐藥率，對厄他培南100%耐藥，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為76.1%和78.3%，對除氨曲南外的其他β-內酰胺類藥物的耐藥率均為100%，對替加環素耐藥率為0，對多黏菌素B（4.3%）及阿米卡星（32.6%）耐藥率較低，見表2。

2.4 碳青霉烯酶表型篩選結果

46株CRKP菌株碳青霉烯酶表型均陽性（100%），其中，單產A類碳青霉烯酶菌株33株（71.7%），單產B類金屬β-內酰胺酶9株（19.6%），單產D類OXA-48型碳青霉烯酶2株（4.3%），同時產A類和B類碳青霉烯酶2株（4.3%），見圖1。

2.5 碳青霉烯酶基因檢測結果

46株CRKP均檢測出碳青霉烯酶基因。其中，33株（71.7%）只攜帶KPC-2基因，7株（15.2%）只攜帶NDM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶VIM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶OXA-48基因，測序證實為OXA-181型，2株（4.3%）同時攜帶KPC-2和NDM-1基因，未檢出IMP型，見圖2。

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物的臨床使用量和強度逐年增加，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率也呈現明顯上升趨勢[7]。近年來，世界衛生組織（WHO）將CRE列為急需投資開發新藥的緊要優先病原菌[8]。2020年全國細菌耐藥監測網（CARSS）報告中顯示，CRKP檢出率為10.9%[7]。本研究中，CRKP標本來源以下呼吸道標本為主，構成比為58.7%，重癥醫學科是CRKP檢出率最高的科室，構成比為69.6%，其次為呼吸內科和移植科，這與陳學敏等[9]報道基本一致。重癥醫學科患者的特點為病情重、機體免疫力下降、入住時間長，大量使用抗菌藥物容易造成CRKP感染。本研究發現46株CRKP對臨床常用抗菌藥物耐藥性較高，對多黏菌素B及阿米卡星耐藥率較低，未檢出對替加環素耐藥菌株，菌株對碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類的耐藥率均低于相關[10-11]研究結果，這可能與菌株的地區分布、病區來源、抗菌藥物選擇性壓力等因素有關。

本研究的46株肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的主要耐藥機制是產生碳青霉烯酶，CRKP主要產A類KPC-2型碳青霉烯酶，其次產B類NDM-1型金屬β-內酰胺酶，與相關研究結果一致[11]。本研究中，KPC-2基因型與NDM-1基因型檢出率分別為 76.1%（35/46）和19.6%（9/46），KPC-2基因型檢出率低于胡小品等[12]報道，這可能與CRKP菌株收集時間較短、地區來源、標本來源及病區分布等有關。本研究還發現2株肺炎克雷伯菌產OXA-48型碳青霉烯酶，該基因型在國內較少見，主要流行于歐洲和拉丁美洲[13]。2016年國內首次報道了產OXA-48基因菌株[14]，與其他OXA家族強水解碳青霉烯類作用的苯唑西林酶不同，OXA-48水解碳青霉烯酶的作用較弱，厄他培南是該酶的最佳底物[15]。本研究還檢出2株CRKP產VIM-1型碳青霉烯酶，該酶型主要見于地中海國家[16]。相關研究發現，頭孢他啶/阿維巴坦（CZA）對大多數產生KPC型和OXA-48型酶CRE具有活性，CZA聯合氨曲南對產金屬β-內酰胺酶CRE有較好的體外抗菌活性[17]。美國感染性疾病協會2022年指南推薦CZA聯合氨曲南用于治療產金屬β-內酰胺酶CRE引起的感染[18]。

國外文獻報道，實驗室如延遲對耐藥菌株諸如產碳青霉烯酶型診斷報告，將導致患者死亡率上升[19]。因此，臨床微生物實驗室及時進行CRKP碳青霉烯酶檢測，將有助于患者精準治療，降低病死率，提高治愈率。本研究采用APB-EDTA 法進行碳青霉烯酶表型檢測，其檢測KPC型、金屬酶和OXA-48型碳青霉烯酶結果與PCR方法檢測結果相符率為100%。周銀娣等[20]報道，APB-EDTA法對產 KPC 酶菌株的符合率為99.2%，對產金屬酶菌株、KPC+金屬酶復合酶的符合率均為100%，其檢測結果與分子生物學檢測結果總體符合率為87.3%。APB-EDTA法簡單易行，結果易讀，可同時檢測A類和B類碳青霉烯酶，便于臨床微生物實驗室開展，為抗感染精準治療提供實驗室依據。周銀娣等[20]報道，APB-EDTA法不能檢出D組OXA酶。本研究采用APB-EDTA法檢測D組OXA酶時，依次使用亞胺培南、美羅培南和厄他培南藥敏紙片進行測試，發現只有采用亞胺培南紙片時才能檢出D組OXA-48型碳青霉烯酶，具體原因有待于進一步研究。

由于CRKP所致感染可選治療藥物有限，應引起臨床高度重視，須進一步加強抗菌藥物合理應用，減少碳青霉烯類等廣譜抗菌藥物的過度使用，遏制耐藥菌在醫院流行播散。

參 考 文 獻

Choby J E， Howard-Anderson J， Weiss DS. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae-clinical and molecular perspectives[J]. J Intern Med， 2020， 287（3）：283-300.

Wyres K L， Lam M M C， Holt K E. Population genomics of Klebsiella pneumoniae[J]. Nat Rev Microbiol， 2020， 8（6）：" 344-359.

喻華， 徐雪松， 李敏， 等.腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規范專家共識[J].中國感染與化療雜志， 2020， 20（6）：" 671-680.

CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 31th ed. CLSI supplement M100-S31［S］. Wayne， PA： Clinical and Laboratory Standard Institute， 2021.

Tsakris A， Poulou A， Bogaerts P， et al. Evaluation of a new phenotypic OXA-48 disk test for differentiation of OXA-48 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae clinical isolates[J]. J Clin Microbiol， 2015， 53（4）： 1245-1251.

Poirel L， Walsh T R， Cuvillier V， et al. Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2011， 70（1）： 119-123.

全國細菌耐藥監測網. 2020年全國細菌耐藥監測報告（簡要版）[EB/OL]. [2021-11-17]. http： //www.carss.cn/Report/Details？aId=808.

Tacconelli E， Carrara E， Savoldi A， et al. WHO pathogens priority list working group. discovery， research， and development of new antibiotics：the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis[J]. Lancet Infect Dis， 2018，18：" 318-327.

陳學敏， 李玉雪， 趙麗， 等.某醫院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥性和臨床分布[J]. 河北醫藥， 2022， 44（8）： 1260-1263.

于夢， 王玉潔， 于清華， 等. 阿維巴坦聯合頭孢他啶、氨曲南或美羅培南對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌活性[J].中國感染控制雜志， 2022， 21（3）： 239-244.

Lin L， Xiao X G， Wang X N， et al. In vitro antimicrobial susceptibility differences between carbapenem-resistant KPC-2-producing and NDM-1-producing Klebsiella pneumoniae in a teaching hospital in northeast China[J]. Microb Drug Resist， 2020，26（2）：" 94-99.

胡小品， 袁國航， 吳瑤瑤， 等. 中國西南地區3所綜合性醫院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌流行病學特征及耐藥性[J]. 中國感染控制雜志， 2022， 21（2）： 121-127.

Gona F， Bongiorno D， Aprile A， et al. Emergence of two novel sequence types（3366 and 3367） NDM-1- and OXA-48-co-producing K. pneumoniae in Italy[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2019， 38（9）：" 1687-1691.

Guo L， An J， Ma Y， et al. Nosocomial outbreak of OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital：" "clonal transmission of ST147 and ST383[J]. PLoS One， 2016， 11（8）： e0160754.

韓仁如， 胡付品. 耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌中OXA-48家族碳青霉烯酶分子流行病學研究進展[J].中國感染與化療雜志， 2019， 19（06）：" 687-690.

姚欣， 馮莉， 朱艮苗.碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分子流行病學及耐藥機制[J].中國抗生素雜志， 2018， 43（01）：" 85-90.

Biagi M， Wu T， Lee M， et al. Searching for the optimal treatment for metallo- and serine-β-lactamase producing Enterobacteriaceae：aztreonam in combination with ceftazidime-avibactam or meropenem-vaborbactam[J]. Antimicrob Agents Chemother. 2019， 63（12）： e01426-19.

Tamma PD， Aitken SL， Bonomo RA， et al. Infectious diseases society of America 2022 guidance on the treatment of extended-spectrum β-lactamase producing Enterobacterales （ESBL-E）， carbapenem-resistant Enterobacterales （CRE）， and Pseudomonas aeruginosa with difficult-to-treat resistance （DTR-P. aeruginosa）[J]. Clin Infect Dis， 2022，19：ciac268.

Cointe A， Bonacorsi S， Truong J， et al. Detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in positive blood culture using an immunochromatographic RESIST-4 O.K.N.V. Assay[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2018， 62（12）：" e01828-18.

周銀娣， 郭燕， 張琴， 等. 3-氨基苯硼酸聯合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶抑制增強試驗檢測腸桿菌目細菌產碳青霉烯酶的研究[J].中國感染與化療雜志， 2022， 22（01）：" 65-71.