南寧地區(qū)某院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型與基因型檢測(cè)

摘要：目的 了解南寧地區(qū)某院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐藥性及碳青霉烯酶產(chǎn)生情況，為CRKP感染防控提供依據(jù)。方法 收集2021年1月至2022年2月臨床分離的CRKP共46株，用Phoenix M50全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)進(jìn)行碳青霉烯酶表型篩選，用PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因。結(jié)果 46株CRKP對(duì)厄他培南100%耐藥，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為76.1%和78.3%，對(duì)除氨曲南外的其他β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率均為100%，對(duì)替加環(huán)素耐藥率為0，對(duì)多黏菌素B（4.3%）及阿米卡星（32.6%）耐藥率較低；碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)檢出單產(chǎn)A類碳青霉烯酶菌株33株（71.7%），單產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶9株（19.6%），單產(chǎn)D類OXA-48型碳青霉烯酶2株（4.3%），同時(shí)產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶2株（4.3%）；46株CRKP均檢出碳青霉烯酶耐藥基因，其中，33株（71.7%）僅攜帶KPC-2基因，7株（15.2%） 僅攜帶NDM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶VIM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶OXA-48基因，2株（4.3%）同時(shí)攜帶KPC-2和NDM-1基因，未檢出IMP型。結(jié)論 某院分離的CRKP對(duì)常見抗菌藥物具有高度耐藥性，主要產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶，應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物合理使用、CRKP酶型檢測(cè)與感染控制，有效防范院內(nèi)感染。

關(guān)鍵詞：碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐藥性；碳青霉烯酶表型；碳青霉烯酶基因型；碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R978.1" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " "文章編號(hào)：1001-8751（2023）02-0118-05

Detection of Carbapenemase Phenotype and Genotype of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in a Hospital of Nanning

Hu Qiao-juan1，Liang Liang2，Chen Xing-chun2，Zhao Li2，Li Jia-qing2

（1 Guangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Nanning" "530003;"2 The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，" "Nanning" "530016）

Abstract： Objective To investigate the drug resistance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP） and the production of carbapenemase in a hospital of Nanning and provide evidence for the prevention and control of CRKP infection. Methods A total of 46 strains of CRKP were collected from January 2021 to February 2022. Antimicrobial susceptibility test of CRKP strains was detected by Phoenix M50 automatic microbial identification and drug sensitivity analyzer， and carbapenemase inhibitor enhancement method was used to detect carbapenemase phenotype. Polymerase chain reaction（PCR） was used to amplify the carbapenemase-encoding drug resistance genes. Results The 46 strains of CRKP were 100% resistant to ertapenem， 76.1% resistant to imipenem and 78.3% resistant to meropenem， respectively. Except for aztreonam， the strains were 100% resistant to β-lactam antibiotics. The resistance rate to tigecycline was 0， and the resistance rate to polycolistin B （4.3%） and amikacin （32.6%） was low. Carbapenemase resistance gene was detected in 46 CRKP strains， of which 33 strains （71.7%） only carried KPC-2 gene， 7 strains （15.2%）" carried NDM-1 gene， 2 strains （4.3%） carried VIM-1 gene， and 2 strains （4.3%） carried OXA-48 gene. Two strains （4.3%） carried both KPC-2 and NDM-1 genes， while IMP genotype was not detected. Carbapenemase resistance gene was detected in 46 CRKP strains， of which 33 strains （71.7%） only carried KPC-2 gene， 7 strains （15.2%）" carried NDM-1 gene， 2 strains （4.3%） carried VIM-1 gene， and 2 strains （4.3%）" carried OXA-48 gene. Two strains （4.3%） carried both KPC-2 and NDM-1 genes， while IMP genotype was not detected.. Conclusion CRKP isolated from a hospital is highly resistant to the common antibacterial drugs and mainly produces KPC-2 carbapenemase. The rational use of antibiotics， detection of CRKP enzyme type and infection control should be strengthened to effectively prevent nosocomial infection.

Key words： carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae;" "carbapenemase;" "drug resistance;" "carbapenemase phenotype;" "carbapenemase genotype;" "carbapenemase inhibition enhancement test

近年來(lái)，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriales，CRE），尤其是肺炎克雷伯菌的分離率呈快速上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著患者的健康和醫(yī)療安全，是全球面臨的嚴(yán)峻公共衛(wèi)生問題[1]。產(chǎn)生KPC型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的最主要機(jī)制[2]。碳青霉烯酶包括Ambler A類、B類和D類，A類最常見，為絲氨酸碳青霉烯酶，以KPC為主；B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，以NDM、IMP、VIM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶，以O(shè)XA-181和OXA-232為主[3]。本文旨在通過檢測(cè)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院近期收集的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）碳青霉烯酶耐藥表型及基因型，以期為臨床精準(zhǔn)抗感染治療及感染防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2021年1月至2022年2月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床分離的CRKP菌株（對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南任一藥物耐藥菌株），共計(jì)46株，剔除同一患者同一部位來(lái)源的重復(fù)菌株。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853（廣西壯族自治區(qū)臨床檢驗(yàn)中心贈(zèng)送）；碳青霉烯酶表型篩選質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706（美國(guó)BD公司惠贈(zèng)）。

1.2 儀器與試劑

Phoenix M50全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀（美國(guó)BD公司），飛行質(zhì)譜儀microflex LT/SH（德國(guó)布魯克公司），PCR擴(kuò)增儀（上海宏石公司），麥?zhǔn)媳葷醿x（美國(guó)BD公司），高速冷凍離心機(jī)（上海力辰公司），水平電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠成像分析系統(tǒng)（廣州譽(yù)維公司）；藥敏紙片亞胺培南（IPM）、美羅培南（MEM）、厄他培南（ETP）與MH培養(yǎng)基（英國(guó)OXIOD公司），空白藥敏紙片（湖南比克曼生物公司），多黏菌素B藥敏試劑（微量肉湯稀釋法）（溫州市康泰生物公司），2×San Taq PCR Mix預(yù)混液、DNA Marker、引物合成（上海生工生物公司），瓊脂糖（西班牙Biowest公司），二甲亞砜（天津科密歐公司），3-氨基苯硼酸（APB）（上海麥克林公司），乙二胺四乙酸（EDTA）（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司）。

1.3 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)

采用布魯克MALDI Biotyper質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，Phoenix M50全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)多黏菌素B中介或耐藥菌株采用微量肉湯稀釋法復(fù)核其最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2021年版文件判斷[4]，頭孢哌酮/舒巴坦藥敏結(jié)果判斷參照腸桿菌目細(xì)菌的頭孢哌酮折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)。替加環(huán)素判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）推薦的折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)（MIC≤2 μg/mL敏感，MIC≥8 μg/mL耐藥）。耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用WHONET 5.6軟件。

1.4 碳青霉烯酶表型篩選

1.4.1 A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)

采用碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)（APB-EDTA法）。使用滅菌去離子水配制0.1 mol/L的EDTA溶液，用二甲亞砜配制30 mg/mL的APB溶液備用。實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行：參照CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法，將待測(cè)菌調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海鶆蛲坎加贛H瓊脂平板上。隨后貼4張相同的碳青霉烯類抗菌藥物紙片（亞胺培南/美羅培南/厄他培南）于瓊脂表面。1張紙片不加任何液體，1張紙片滴加APB溶液10 μL，1張紙片滴加EDTA溶液10 μL，最后1張紙片同時(shí)滴加APB溶液和EDTA溶液各10 μL，過夜培養(yǎng)后量取紙片抑菌圈直徑。結(jié)果判讀如下：（1）添加APB溶液的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷待測(cè)菌產(chǎn)A類碳青霉烯酶；（2）添加EDTA溶液的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷待測(cè)菌產(chǎn)B類碳青霉烯酶；（3）如僅同時(shí)添加APB和EDTA的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，可判斷該待測(cè)菌同時(shí)產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶；（4）如含酶抑制劑的碳青霉烯類紙片抑菌圈直徑與單藥相差均＜5 mm，可判斷該菌不產(chǎn)A類或B類碳青霉烯酶。

1.4.2 D類OXA-48型碳青霉烯酶檢測(cè)

對(duì)不產(chǎn)A類或B類碳青霉烯酶的菌株同樣采用APB-EDTA法檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶。使用滅菌去離子水配制0.1 mol/L的EDTA溶液，用二甲亞砜配制60 mg/mL的APB溶液備用。實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行：參照CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法，將大腸埃希菌ATCC 25922調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海鶆蛲坎加贛H瓊脂平板上。將1張亞胺培南紙片貼于瓊脂表面，取2張無(wú)菌空白紙片，每張紙片取待測(cè)菌純分菌落3～4個(gè)，在亞胺培南左右各貼上1張已取待測(cè)菌的空白藥敏紙片。然后在亞胺培南紙片左邊的空白紙片加EDTA溶液10 μL，在亞胺培南紙片右邊的空白紙片同時(shí)加EDTA溶液和APB溶液各10 μL。過夜孵育后判讀結(jié)果：（1）含EDTA或APB空白紙片均出現(xiàn)細(xì)菌矢狀生長(zhǎng)者，提示該菌產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶；（2）含EDTA或APB空白紙片均未出現(xiàn)細(xì)菌矢狀生長(zhǎng)者，提示該菌產(chǎn)B類碳青霉烯酶；（3）僅含EDTA空白紙片出現(xiàn)細(xì)菌矢狀生長(zhǎng)者，提示該菌產(chǎn)A類碳青霉烯酶。

1.5 碳青霉烯酶基因檢測(cè)

采用加熱煮沸法提取細(xì)菌 DNA 模板，PCR擴(kuò)增5種常見的CRKP耐藥基因，引物參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)，見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×San Taq PCR Mix預(yù)混液12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共36個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果并拍照。將部分?jǐn)U增產(chǎn)物送上海生工生物公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定CRKP菌株攜帶的碳青霉烯酶基因型。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本來(lái)源

46株CRKP分離自下呼吸道27株（58.7%）、尿液6株（13.0%）、血液5株（10.9%）、腹水3株（6.5%）、膿液2株（4.3%）、其他標(biāo)本3株（6.6%）。

2.2 科室分布

重癥醫(yī)學(xué)科32株（69.6%）、呼吸內(nèi)科4株（8.7%）、移植科4株（8.7%）、急診科2株（4.3%）、康復(fù)科1株（2.2%）、胃腸外科1株（2.2%）、消化內(nèi)科1株（2.2%）、心血管內(nèi)科1株（2.2%）。

2.3 CRKP對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率

46株CRKP對(duì)常用抗菌藥物有較高的耐藥率，對(duì)厄他培南100%耐藥，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為76.1%和78.3%，對(duì)除氨曲南外的其他β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率均為100%，對(duì)替加環(huán)素耐藥率為0，對(duì)多黏菌素B（4.3%）及阿米卡星（32.6%）耐藥率較低，見表2。

2.4 碳青霉烯酶表型篩選結(jié)果

46株CRKP菌株碳青霉烯酶表型均陽(yáng)性（100%），其中，單產(chǎn)A類碳青霉烯酶菌株33株（71.7%），單產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶9株（19.6%），單產(chǎn)D類OXA-48型碳青霉烯酶2株（4.3%），同時(shí)產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶2株（4.3%），見圖1。

2.5 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果

46株CRKP均檢測(cè)出碳青霉烯酶基因。其中，33株（71.7%）只攜帶KPC-2基因，7株（15.2%）只攜帶NDM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶VIM-1基因，2株（4.3%）僅攜帶OXA-48基因，測(cè)序證實(shí)為OXA-181型，2株（4.3%）同時(shí)攜帶KPC-2和NDM-1基因，未檢出IMP型，見圖2。

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物的臨床使用量和強(qiáng)度逐年增加，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[7]。近年來(lái)，世界衛(wèi)生組織（WHO）將CRE列為急需投資開發(fā)新藥的緊要優(yōu)先病原菌[8]。2020年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CARSS）報(bào)告中顯示，CRKP檢出率為10.9%[7]。本研究中，CRKP標(biāo)本來(lái)源以下呼吸道標(biāo)本為主，構(gòu)成比為58.7%，重癥醫(yī)學(xué)科是CRKP檢出率最高的科室，構(gòu)成比為69.6%，其次為呼吸內(nèi)科和移植科，這與陳學(xué)敏等[9]報(bào)道基本一致。重癥醫(yī)學(xué)科患者的特點(diǎn)為病情重、機(jī)體免疫力下降、入住時(shí)間長(zhǎng)，大量使用抗菌藥物容易造成CRKP感染。本研究發(fā)現(xiàn)46株CRKP對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥性較高，對(duì)多黏菌素B及阿米卡星耐藥率較低，未檢出對(duì)替加環(huán)素耐藥菌株，菌株對(duì)碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類的耐藥率均低于相關(guān)[10-11]研究結(jié)果，這可能與菌株的地區(qū)分布、病區(qū)來(lái)源、抗菌藥物選擇性壓力等因素有關(guān)。

本研究的46株肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶，CRKP主要產(chǎn)A類KPC-2型碳青霉烯酶，其次產(chǎn)B類NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶，與相關(guān)研究結(jié)果一致[11]。本研究中，KPC-2基因型與NDM-1基因型檢出率分別為 76.1%（35/46）和19.6%（9/46），KPC-2基因型檢出率低于胡小品等[12]報(bào)道，這可能與CRKP菌株收集時(shí)間較短、地區(qū)來(lái)源、標(biāo)本來(lái)源及病區(qū)分布等有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)2株肺炎克雷伯菌產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶，該基因型在國(guó)內(nèi)較少見，主要流行于歐洲和拉丁美洲[13]。2016年國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了產(chǎn)OXA-48基因菌株[14]，與其他OXA家族強(qiáng)水解碳青霉烯類作用的苯唑西林酶不同，OXA-48水解碳青霉烯酶的作用較弱，厄他培南是該酶的最佳底物[15]。本研究還檢出2株CRKP產(chǎn)VIM-1型碳青霉烯酶，該酶型主要見于地中海國(guó)家[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，頭孢他啶/阿維巴坦（CZA）對(duì)大多數(shù)產(chǎn)生KPC型和OXA-48型酶CRE具有活性，CZA聯(lián)合氨曲南對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶CRE有較好的體外抗菌活性[17]。美國(guó)感染性疾病協(xié)會(huì)2022年指南推薦CZA聯(lián)合氨曲南用于治療產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶CRE引起的感染[18]。

國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)室如延遲對(duì)耐藥菌株諸如產(chǎn)碳青霉烯酶型診斷報(bào)告，將導(dǎo)致患者死亡率上升[19]。因此，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室及時(shí)進(jìn)行CRKP碳青霉烯酶檢測(cè)，將有助于患者精準(zhǔn)治療，降低病死率，提高治愈率。本研究采用APB-EDTA 法進(jìn)行碳青霉烯酶表型檢測(cè)，其檢測(cè)KPC型、金屬酶和OXA-48型碳青霉烯酶結(jié)果與PCR方法檢測(cè)結(jié)果相符率為100%。周銀娣等[20]報(bào)道，APB-EDTA法對(duì)產(chǎn) KPC 酶菌株的符合率為99.2%，對(duì)產(chǎn)金屬酶菌株、KPC+金屬酶復(fù)合酶的符合率均為100%，其檢測(cè)結(jié)果與分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果總體符合率為87.3%。APB-EDTA法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果易讀，可同時(shí)檢測(cè)A類和B類碳青霉烯酶，便于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展，為抗感染精準(zhǔn)治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。周銀娣等[20]報(bào)道，APB-EDTA法不能檢出D組OXA酶。本研究采用APB-EDTA法檢測(cè)D組OXA酶時(shí)，依次使用亞胺培南、美羅培南和厄他培南藥敏紙片進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)只有采用亞胺培南紙片時(shí)才能檢出D組OXA-48型碳青霉烯酶，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

由于CRKP所致感染可選治療藥物有限，應(yīng)引起臨床高度重視，須進(jìn)一步加強(qiáng)抗菌藥物合理應(yīng)用，減少碳青霉烯類等廣譜抗菌藥物的過度使用，遏制耐藥菌在醫(yī)院流行播散。

參 考 文 獻(xiàn)

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