常見市售清洗劑對硅膠表面銅綠假單胞菌生物膜的清除能力評估

摘要：目的 觀察硅膠表面銅綠假單胞菌生物膜的形成，對比3種清洗劑對生物膜的清除能力。方法 利用掃描電子顯微鏡觀察經加片建模法構建的生物膜形態，采用結晶紫半定量和菌落計數定量法檢測硅膠表面生物膜量。結果 培養3 d 硅膠表面生物膜量明顯高于d 1和d 5。清洗后掃描電子顯微鏡觀察d 3各組生物膜量明顯減少但有殘留。結晶紫半定量法證實Intercept清洗劑對培養3 d的生物膜有極顯著清除能力（0.19±0.05）（P﹤0.01）；Zen清洗劑有顯著清除能力（0.25±0.08）（P﹤0.05）。菌落計數定量法證實培養3 d 經Intercept和Zen清洗劑作用后菌落計數分別為（0.98±0.30）（P﹤0.01）、（2.79±1.15）×101（P﹤0.05）。魯沃夫清洗劑對培養3 d的生物膜清除無統計學意義。結論 培養3 d的銅綠假單胞菌生物膜量最多，黏附力最強。Intercept清洗劑對各個培養時間的生物膜均有清除能力，尤其對培養3 d的成熟的生物膜也有較好的清除作用，Zen清洗劑效果次之。

關鍵詞：生物膜；清洗劑；銅綠假單胞菌；清除；硅膠

中圖分類號：R978" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2023）02-0108-05

Evaluation of Ability of Common Commercial Cleaning Agents to Remove Pseudomonas aeruginosa Biofilm on the Surface of Silica Gel

Zhu Si-xia1， Qin Yi-sha2， Yan Pan1

（1 School of Basic Medicine， Panzhihua University， Panzhihua 617000; 2 Panzhihua Central Hospital， Panzhihua 617000）

ABSTRACT： Objective" To observe the formation of Pseudomonas aeruginosa biofilm on the surface of silica gel and compare the scavenging ability of three cleaning agents. Methods" Scanning electron microscopy was used to observe the morphology of the biofilm constructed by adding slices， and the amount of biofilm on the surface of silica gel was measured by semi quantitative crystal violet and quantitative colony count. Results" The amount of biofilm on the surface of silica gel cultured for 3 days was significantly higher than that on the 1st and 5th days. After cleaning， the amount of biofilm in each group was significantly reduced but there was residue on the 3rd day by scanning electron microscopy. The crystal violet semi quantitative method confirmed that Intercept detergent had a very significant scavenging ability （0.19±0.05） to the biofilm cultured for 3 days （P ＜ 0.01）; Zen detergent had significant scavenging ability （0.25±0.08） （P ＜ 0.05）. The quantitative method of colony count confirmed that the colony count after three days of culture by Intercept and Zen detergent was （0.98±0.30） （P ＜ 0.01）， （2.79±1.15） （P ＜ 0.05）， respectively. There was no statistical significance in the removal of biofilm by RUHOF detergent after 3 days of culture. Conclusion" The biofilm of Pseudomonas aeruginosa cultured for 3 days has the largest amount and the strongest adhesion. Intercept detergent has a very significant scavenging effect on the biofilm on the surface of silica gel cultured for 3 days.

Key words： biofilm;" "cleaning agent;" "Pseudomonas aeruginosa;" "eliminate;" "silica gel

1 前言

生物膜（Biofilm，BF）是細菌之間通過分泌的胞外多糖等物質彼此黏附形成的膜狀細菌群體[1]，能緊密黏附于生命或非生命物質表面且難以去除。BF多細胞結構的形成是一個動態過程，包括細菌起始黏附、生物膜發展和成熟擴散等階段[2-3]。由于BF黏附力強，醫用硅膠材料表面一旦形成細菌BF，常規的清洗甚至消毒液作用后致病菌仍能持續存在，造成頑固性感染。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是醫院內感染最常見的細菌之一，隨著各種侵入性操作技術廣泛開展，其臨床分離率每年以一定幅度增長[4-5]。PA在適應環境和定植宿主過程中常黏附在機體組織或人工裝置表面形成BF，造成持續的慢性感染[6]。

醫用硅膠由于具有無毒無味、耐高溫、抗老化、性能穩定、生物適應性強等優點[7]，經常在靜脈導管、胃管、導尿管、呼吸機管路、人工關節、人工心臟瓣膜、人工肺、骨黏合劑中被廣泛使用[8]。細菌能黏附于醫用硅膠材料表面形成BF，由于難以將其清除，可作為長期的細菌來源庫，成為感染性疾病的潛在危險因素[9]。本研究通過建立硅膠表面BF模型，評估3種常見市售清洗劑對醫用硅膠表面PA菌BF的清除能力，為防止臨床感染的發生具有重要的現實指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銅綠假單胞菌PAO1菌株 （攀枝花市中心醫院檢驗科）；Zen生物膜特效清洗劑[楷騰醫療設備（中國）有限公司代理]；魯沃夫（RUHOF）全效型多酶清洗劑（杭州魯沃夫貨物進出口有限公司）；Intercept生物膜特效清洗劑（美國Cantel公司）。

胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptose soya broth，TSB）（上海廣銳生物科技有限公司）；LB營養瓊脂（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）[生工生物工程（上海）股份有限公司]；2.5%戊二醛（上海信裕生物科技有限公司）；乙醇、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、結晶紫（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

RF1-20酶標儀（南京華東電子集團醫療裝備有限公司）；722N可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；SW-CJ-2FD醫用凈化工作臺（蘇州博萊爾凈化設備有限公司）；BSC-250恒溫恒濕箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；Sigma 500場發射掃描電子顯微鏡（德國Zeiss集團）；JE 748硅膠膜（厚0.5 mm，深圳市嘉杰橡塑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 加片建模法構建細菌BF

將PA標準株用TSB稀釋，制成菌懸液，分光光度計調至OD值為0.1（約1×107 CFU/mL）備用。實驗設PA組和空白組（只加TSB）。吸取菌液和TSB各2 mL分別加入24孔板，每組設6個復孔，用無菌鑷將0.8 cm×0.8 cm的無菌硅膠膜片載體放入24孔板，使浸沒菌液中，建立細菌BF[9-10]。37 ℃恒溫恒濕箱培養，隔天更換TSB培養液一次。分別培養1、3和5 d后取出硅膠膜片，按以下方法檢測細菌BF。

1.3.2 掃描電子顯微鏡法鑒定BF

將菌液培養的硅膠膜片取出，用PBS輕輕洗滌3次，加入2.5%戊二醛，放置室溫下2 h固定；PBS清洗3次；用20%、40%、60%、80%、100%、100%、100%乙醇梯度脫水，每次20 min；最后取出硅膠膜片，自然干燥，離子濺射噴金，在掃描電子顯微鏡下觀察細菌BF[9，11]。

1.3.3 結晶紫半定量法檢測BF

吸棄24孔板中的菌液，用PBS輕柔沖洗硅膠膜片，反復3次，每孔加入2%結晶紫染液400 μL，染色30 min；PBS充分清洗；將載體轉入新的24孔板，每孔加400 μL的二甲基亞砜脫色15 min[12]，取100 μL脫色液加入96孔板。酶標儀檢測OD570值。

1.3.4 菌落計數法定量檢測生物膜

無菌PBS沖洗培養1、3和5 d的硅膠膜片，PE管中加入5 mL PBS，取出硅膠膜片放入PE管中，22.7℃、300 r/min振蕩10 min[13]。吸取1 mL菌液用PBS分別稀釋成10-1、10-2、10-3，取1 mL注入無菌平皿，將20 mL LB瓊脂培養液倒入培養皿，輕輕搖勻，37 ℃培養24 h后計數菌落。

1.3.5 清洗BF

取出培養1、3、5 d的硅膠膜片放入試管中。實驗用清洗劑分別為Zen生物膜特效清洗劑組（稀釋比例1：250）、魯沃夫（RUHOF）全效型多酶清洗劑組（稀釋比例1：270）、Intercept生物膜特效清洗劑組（稀釋比例1：200）、無菌水對照組，每組各10 mL。恒溫振蕩器中22 ℃、100 r/min清洗5 min，再將硅膠膜片置于24孔板，PBS反復清洗，無菌紗布擦干備用[14-15]。分別再次進行上述實驗（掃描電子顯微鏡法、結晶紫半定量法、菌落計數法），觀察或檢測清洗后硅膠表面的BF。

1.4 數據處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。所有實驗重復3次，實驗結果以平均值±標準偏差表示。組間比較用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡觀察細菌BF

掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）動態觀察硅膠表面銅綠假單胞菌BF見圖1。培養d 1細菌BF初步形成，細菌被一些黏絲狀多糖復合物連接。d 3細菌BF形成明顯，大量細菌牢固黏附在膜片上，形成厚厚的致密的膜狀物。第5 d細菌BF覆蓋面積和厚度減小，細菌數量減少。

清洗后SEM動態觀察硅膠表面銅綠假單胞菌BF見圖2。觀察第1 d，經Zen和無菌水清洗后，細菌及BF細菌間多糖復合物有少許殘留；而Intercept和魯沃夫清洗后，細菌和多糖復合物幾乎消失。觀察d 3，經各組清洗劑和無菌水清洗后，硅膠表面雖然比清洗前細菌數量大大減少及BF厚度變薄，但仍然殘留些許細菌，其中魯沃夫組和無菌水組清洗殘留最多，且細菌間仍被少量多糖復合物彼此黏附。觀察d 5，經Zen清洗后，除了少許細菌外，還能看到被分解的殘破的細菌多糖復合物；Intercept清洗后，只存零星的細菌碎片；而魯沃夫和無菌水清洗后，細菌殘留相對比較多，部分細菌間仍有黏附。

2.2 結晶紫半定量法檢測BF

清洗前硅膠表面銅綠假單胞菌生物膜量見表1。PA組間比較，d 3 BF的形成明顯高于d 1和d 5 （P＜0.01），表明BF d 1尚未形成或初步形成，d 3形成顯著增加，d 5形成減少。PA組與空白組比較，d 1差異無統計學意義（P＞0.05），d 3、d 5差異有統計學意義（P＜0.05），均提示上述結果，但d 5 BF雖然減少卻有部分存在。

不同清洗劑對不同時間點BF量的清洗效果見表2。d 3三種清洗劑與無菌水組比較BF量減少（P＜0.05），表明3種清洗劑對早期BF均有清除作用，但三種清洗劑比較BF量無明顯差異。d 3 Intercept組與無菌水組比較BF量差異極顯著（P＜0.01），Zen組與無菌水組比較有明顯差異（P＜0.05），兩種清洗劑比較差異有顯著意義（P＜0.05）。d 5 Zen組和Intercept組與無菌水組比較BF量明顯減少（P＜0.01），提示該兩種清洗劑對晚期BF清除效果顯著，但兩種清洗劑比較亦無明顯差異。

2.3 生物膜活菌計數

清洗前硅膠表面PA菌生物膜菌落計數見表3。與空白組相比，d 1、d 3、d 5 PA組的菌落數量均有極顯著提高（P＜0.01），說明PA組形成BF，其中含較多細菌。PA組間比較，d 3 BF中菌落數量高于d 1和d 5 （P＜0.05），表明BF的形成d 3比d 1顯著增加，d 5減少。

清洗后硅膠表面PA菌生物膜菌落計數見表4。與無菌水組相比，d 1三種清洗劑清洗后菌落數均減少（P＜0.05）；d 3 Intercept組菌落數極顯著減少（P＜0.01），Zen組菌落數顯著減少（P＜0.05）；d 5清洗后Zen組和Intercept組菌落數均極顯著減少（P＜0.01），d 3、d 5魯沃夫組清洗無效（P＞0.05）。清洗劑組間相比，d 3 Intercept組比Zen組清除效果好（P＜0.05），d 5 Intercept組與Zen組清除效果無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論與結論

本研究采用硅膠為載體，構建PA菌BF模型，模擬臨床醫療植入常用材料—硅膠引發的感染，使其盡可能地符合臨床應用的實際情況。另外，掃描電子顯微鏡法、結晶紫半定量法和菌落計數法是研究細菌BF的3種經典方法[12，16-17]。掃描電子顯微鏡顯示了PA菌BF從形成到成熟到衰退過程的變化。培養1 d的PA菌能黏附在硅膠表面，在培養d 3時，硅膠表面形成的PA菌BF最厚，細菌含量最多，結構最致密，這與梁金正等[18]報道的PA定植在骨科鋼板內固定物上3 d后形成成熟的BF相似。李虹[19]也報道金黃色葡萄球菌可以在各種材料表面形成BF，并在96 h時達到峰值。但胡銀清等[11]報道，在聚四氟乙烯管管腔連續培養PA形成成熟穩定BF的時間為6 d，原因可能與選擇的BF載體材料和BF建立的方法不同有關。陳穎[20]分析細菌在生物材料上的早期黏附與生物材料自身攜帶的電荷和疏水等理化作用力有關。硅膠表面的聚烴基成分疏水性好，攜帶的電荷及材料中的孔隙利于細菌黏附和BF的形成。在培養d 5時，PA菌BF明顯縮小，BF中部分細菌固縮、崩解，呈現游離狀態，可能由于BF內營養成分逐漸被消耗，細菌分泌的多糖等黏附物質減少或分解，導致外層細菌與主體連接不緊密并脫落[21]。結晶紫半定量和菌落計數定量實驗均顯示PA菌BF的形成與掃描電子顯微鏡結果具有一致性。

硅膠表面BF被清洗后，綜合3種實驗分析，Intercept和Zen清洗劑對各時間點PA的BF清除效果均較好，但對培養3 d生物膜的清除殘留相對較多，而魯沃夫清洗劑和無菌水亦對培養d 3的成熟BF清除不徹底，原因可能是d 3細菌BF形成最成熟，牢固黏附生物材料，導致各種清洗劑很難將其洗脫下來。這也驗證了BF細菌較浮游細菌對物質或組織細胞的黏附能力大大增強，常規方法難以將其清除，導致細菌感染率增加。但總體來說Intercept對各期BF清除效果都比較顯著，建議選擇清洗劑時可以優先選擇。

雖然本研究模擬了硅膠表面PA菌BF的形成過程，但是鑒于臨床應用環境的復雜性，距離BF的實際形成情況尚存在一定差距，應進一步實時觀察臨床醫療活動中生物膜的動態形成過程。另外，可以采取措施提前預防臨床醫用硅膠表面BF的形成，文獻研究顯示[22]可對生物材料表面進行改性，以抑制BF的形成。生物材料改性主要從物理和化學兩方面進行。物理方法可以通過潤滑性水凝膠以及表面微納結構修飾來潤滑及降低細菌黏附力[23]。化學方法則可通過抗菌抗結晶涂層，將分子泵抑制劑、一氧化氮、抗生素及抗菌肽等作用于細菌的物質附著在植入材料表面[24-26]，以達到抑制細菌的黏附、定植、增殖及生物膜形成的效果。生物膜細菌的噬菌體處理或生物控制技術的發展[27-29]提示還可以用噬菌體攻擊作為一種對抗環境生物膜的策略。

本研究得出結論，PA能在硅膠表面形成BF，在BF成熟階段黏附力極強，Intercept生物膜特效清洗劑對各期BF清除均有效，尤其對培養3d的成熟的BF也具有較好的清除能力，Zen生物膜特效清洗劑其次，但魯沃夫多酶清洗劑對成熟PA菌BF的清除能力有限。建議可通過物理、化學或生物方法對硅膠材料改性，以抑制細菌BF的形成，預防BF引發的臨床感染性疾病。

參 考 文 獻

Apoorva V， Francis D， Allison F， et al. Peptidomimetic polyurethanes inhibit bacterial biofilm formation and disrupt surface established biofilms [J]. J Am Chem Soc， 2021， 143（25）： 9440-9449.

宋雪艷， 劉志歡， 謝翠萍， 等. 細菌生物被膜形成的調控機制與消除方法[J]. 動物醫學進展， 2022， 43（3）： 112-115.

Nandakumar V， Chittaranjan S， Mathew-kurian V， et al. Characteristics of bacterial biofilm associated with implant material in clinical practice [J]. Polym J， 2013， 45（Suppl 3）： 137-152.

劉云寧， 李小鳳， 湯建華， 等. 磷霉素與其他抗菌藥物對多重耐藥銅綠假單胞菌的聯合藥敏試驗研究[J]. 中國感染控制雜志， 2021， 20（12）： 1149-1152.

張新穎， 韓穎， 王雅妹， 等. 銅綠假單胞菌耐藥性與抗菌藥物使用強度相關性分析[J]. 河北大學學報（自然科學版）， 2021， 41（02）： 188-194.

李賢煌， 周夢嬌， 畢正琴， 等. 環二鳥苷酸對銅綠假單胞菌的生物膜形成及消毒劑抗性的影響[J]. 中國消毒學雜志， 2022， 39（04）： 241-244+247.

李兆雙， 李建芳， 劉鶴， 等. 生物醫用硅橡膠表面抗菌性能改造研究進展[J]. 化工進展， 2018， 37（12）： 4719-4725.

董俊杰. 硝酸鎵涂層的TiO2納米管材料對金黃色葡萄球菌—大腸桿菌混合生物膜作用的研究[D]. 昆明： 昆明醫科大學， 2018.

任敏， 李子慧， 陳佩云， 等. 不同材質導尿管對生物膜形成與導管相關性尿路感染的影響研究[J]. 中國消毒學雜志， 2020， 37（04）： 254-256+259.

郭錦錦， 蘆起， 馮蕾， 等. 青蒿琥酯對銅綠假單胞菌生物膜形成及結構的影響[J]. 基因組學與應用生物學， 2018， 37（8）： 3733-3739.

胡銀清， 劉曉利， 李娜， 等. 不同清洗劑對軟式內鏡銅綠假單胞菌生物膜去除效果的研究[J]. 中國消毒學雜志， 2020， 37（12）： 884-887.

王央霞， 孫婷， 馬俊芬， 等. 血清及其成分對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響[J]. 臨床檢驗雜志， 2019， 37（1）： 11-13.

任偉， 黃茜， 石彩曉， 等. 不同培養時間對大腸埃希菌生物膜形成影響[J]. 中國公共衛生， 2013， 29（2）： 242-244.

張曉娜， 李武平， 徐修禮， 等. 酸性氧化電位水對多重耐藥銅綠假單胞菌生物膜清除作用的研究[J]. 中國消毒學雜志， 2016， 33（3）： 207-209.

Abel T， Daniel B， Mario C， et al. Multispecies biofilm removal by ×P-endo finisher and passive ultrasonic irrigation： A scanning electron microscopy study [J]. Aust Endod J， 2021， 48（1）： 91-97.

李更森， 涂榮祖， 洪訓宇， 等. 異綠原酸聯合抗生素對銅綠假單胞菌-煙曲霉混合生物被膜的體外協同抑菌作用[J]. 中華微生物學和免疫學雜志， 2020， 40（10）： 763-767 .

Fritz B G， Walker D K， Goveia D E， et al. Evaluation of petrifilm （TM） aerobic count plates as an equivalent alternative to drop plating on R2A agar plates in a biofilm disinfectant efficacy test [J]. Curr Microbiol， 2015， 70（3）： 450-456.

梁金正， 邵欣欣， 杜少華， 等. 次氯酸對骨科內固定物表面細菌生物膜的清除作用[J]. 中國組織工程研究， 2022， 26（15）： 2367-2371.

李虹. 環二肽對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制機制研究及其應用[D]. 鎮江： 江蘇大學， 2021.

陳穎. 肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌生物膜的形成與宿主免疫功能的關系[D]. 昆明： 昆明醫科大學， 2015.

楊繼琛， 黃云超， 葉聯華. 白色念珠菌與表皮葡萄球菌混合生物膜研究進展[J]. 重慶醫學， 2019， 48（15）：" 2637-2640+2645.

王立蓉. 抗感染功能硅橡膠醫用導管涂層的制備與性能研究[D]. 沈陽： 遼寧大學， 2020.

Goda-reham M， Elbaz-ahmed M， Khalaf-eman M， et al. Combating bacterial biofilm formation in urinary catheter by green silver nanoparticle [J]. Antibiot， 2022， 11（4）： 495.

林承雄， 黃正宇， 王耀程， 等. 導尿管抑菌涂層的研究進展[J/OL]. 表面技術： 1-24. [2022-05-13]. http： //kns. cnki. net/kcms/detail/50. 1083. TG. 20220331. 1815. 002. html.

Daseul K， Kiyoung K. Pectolinarin inhibits the bacterial biofilm formation and thereby reduces bacterial pathogenicity [J]. Antibiot， 2022， 11（5）： 598.

Aleksandra I， Kristina I， Tzanko T. Simultaneous ultrasound-assisted hybrid polyzwitterion/anti-microbial peptide nanoparticles synthesis and deposition on silicone urinary catheters for prevention of biofilm-associated infections [J]. Nanomater， 2021， 11（11）： 3143.

王猛， 邵煜涵， 王策， 等. 噬菌體治療感染性疾病的機制特點及研究進展[J]. 中國處方藥， 2022， 20（6）： 154-157.

Pires D P， Meneses L， Brandao A C， et al. An overview of the current state of phage therapy for the treatment of biofilm-related infections [J]. Curr Opin Virol， 2022， 53： 101209.

Kazmierczak N， Grygorcewiczb， Roszak M， et al. Comparative assessment of bacteriophage and antibiotic activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus biofilms [J]. Int J Mol Sci， 2022， 23（3）： 1274-1274.