柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子偏好性分析

摘要：闡明柔毛郁金香（Tulipa buhseana）葉綠體基因組密碼子使用模式，豐富野生郁金香種質資源的遺傳背景信息。以柔毛郁金香的53條蛋白編碼序列（CDS）為研究對象，結合Codon W、EMBOSS在線軟件及R語言，計算密碼子數量、有效密碼子數、GC含量，并通過中性繪圖分析、PR2-plot分析、ENC-plot分析的多元統計，對密碼子使用偏好模式進行預測并篩選最優密碼子。柔毛郁金香葉綠體基因組53條CDS的平均GC含量為37.21%，不同位置的GC含量為GC1（45.5%）＞GC2（37.85%）＞GC3（28.27%），表明柔毛郁金香葉綠體基因組的密碼子第3位堿基組成多為A和T。多元統計分析表明，柔毛郁金香葉綠體基因組的密碼子偏好性主要受自然選擇的影響，并篩選到17個最優密碼子同時滿足高頻率密碼子和高表達優越密碼子的條件。柔毛郁金香葉綠體基因組的密碼子偏性較弱，均以A或U結尾，自然選擇是影響密碼子偏性的主要因素。研究結果可為后續開展郁金香葉綠體基因工程、野生郁金香種群演化及系統分類以及發育研究奠定基礎。

關鍵詞：柔毛郁金香；葉綠體基因組；密碼子偏好性；最優密碼子

中圖分類號：S682.2+63.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0041-06

密碼子在生物體遺傳信息傳遞的過程中扮演著重要的角色。遺傳信息的傳遞經歷了一個逐步進化的過程，其中非常必要的環節是通過使用氨基酸，而三聯體密碼子編碼蛋白質的結構單位必不可少［1］。mRNA上每3個相鄰的堿基決定1個氨基酸，這3個堿基被稱為1個密碼子［2］，在對蛋白質進行翻譯的過程中，同義密碼子會針對同一種氨基酸的不同密碼子進行編碼。由于基因突變和自然選擇的存在，不同物種的遺傳密碼子使用模式存在較大差異，表現為編碼同一氨基酸的不同密碼子的使用頻率不一樣，即密碼子使用偏好性［3］。密碼子的使用模式會對基因的功能與表達產生一定程度的影響，如密碼子偏好性越強，該物種的基因表達量就會越大［4］。因此，通過物種密碼子的使用偏好模式可以推斷或預測未知基因的表達和功能，尤其是在基因組層面有助于理解生物的分子進化和環境適應表現［5］。

葉綠體是綠色植物獨有的細胞器，是植物進行光合作用的場所，一般認為高等植物的葉綠體具有一套自己獨立的遺傳物質，即葉綠體基因組［6］。葉綠體DNA（cpDNA）是一個環狀雙鏈分子，包含2個反向重復序列（inverted repeat sequence，簡稱IR），并被2段大小不等的非重復序列隔開，在不同植物中非重復序列的長度具有差異，如花椒）LSC和SSC的長度分別為85 898、17 611 bp，而川陜花椒LSC和SSC的長度分別為85 821、17 556 bp［7］。多數植物的cpDNA大小約為150 kb，能編碼120種左右的蛋白質，包含轉錄和翻譯相關基因、光合作用相關基因、氨基酸及脂肪酸等生物合成有關的基因。近年來，大量植物的葉綠體基因組被公布，為葉綠體基因組的密碼子偏好性分析提供了基礎數據，同時為探討植物的生命進化和調控基因表達具有重要意義。

郁金香，別稱洋荷花、草麝香，作為非常重要的觀賞花卉之一，是土耳其、荷蘭等國的國花［8］。郁金香為百合科郁金香屬植物，而郁金香屬植物大約有150種，分布在我國的有14種，以野生郁金香資源為主，占世界總資源的10%以上［9］，其中包括柔毛郁金香（Tulipa buhseana）、準噶爾郁金香、伊犁郁金香、天山郁金香等［10］。柔毛郁金香花型優美、花色明亮，主要分布在新疆北部（富蘊）和西部（伊寧）地區，多見于平原或低山草坡［11］。因其較強的環境適應性，可作為國產郁金香品種選育的重要親本，但針對這一類優異郁金香野生種質資源的相關研究鮮有報道。

隨著高通量基因測序技術的發展，通過葉綠體基因組可為基因的改良、目標基因的優化提供依據［12］。葉綠體基因組為單親遺傳，堿基很少發生替換，使其在植物分類及系統進化研究中具有獨特的優勢［13］。目前柔毛郁金香的葉綠體基因組已發布，通過對柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子的使用模式與偏好性進行系統研究，可豐富野生郁金香種質資源的遺傳背景信息，結合篩選的最優密碼子提高目的基因的表達量，輔助研究野生種質資源適應外界環境的分子機制，為后續開展郁金香葉綠體基因工程、野生郁金香種群演化及系統發育研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2022年9月從NCBI數據庫下載由筆者所在課題組前期測序獲得的完整柔毛郁金香葉綠體基因組序列（GenBank登錄號：MT316022），根據各基因的注釋結果獲得87條可以編碼蛋白的基因序列（coding DNA sequence，CDS）。為提高數據的可用性，剔除了序列長度小于300 bp、重復基因和CDS內部存在終止密碼子的序列，最終保留53條CDS用于后續密碼子參數分析。

1.2 分析方法

1.2.1 密碼子組成分析

53條CDS以fasta格式在CodonW 1.4.2 在線軟件（http：//codonw sourceforge net）中運行，計算每個基因的密碼子數量、有效密碼子數（effective number of codon，ENC）、同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）；通過EMBOSS在線軟件（https：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）分析GC含量（分別為GC1、GC2、GC3）及3位堿基的GC平均含量（GCall）。使用R語言軟件包完成相關性分析。

1.2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析在以GC3為橫坐標，GC12（GC1和GC2的平均值）為縱坐標的二維散點圖中，每1個散點代表1個基因。通過繪圖結果中所有基因是否按對角線分布來判斷堿基組成的差異性，并根據對角線斜率來衡量中性程度。

1.2.3 ENC-plot繪圖分析

ENC-plot繪圖分析包括構建二維散點圖和統計ENC比值頻數。散點圖以ENC為縱坐標，GC3為橫坐標，根據散點的分布位置繪制標準曲線并通過散點與標準曲線的距離來判斷堿基組成與各基因密碼子使用偏好性的關系。根據ENC的期望值與實際值的偏差來判斷密碼子使用模式的影響因素。

1.2.4 PR2-plot分析

PR2-plot分析是通過各密碼子第3位上的A、T、C、G的含量，以A3/（A3+T3）為縱坐標，以G3/（G3+C3）為橫坐標，用平面圖顯示各基因的堿基組成，中心點代表無偏性使用時的密碼子狀態，即A=T且C=G，其余點與中心點的矢量距離代表其偏倚程度和方向。

1.2.5 最優密碼子

以各基因的有效密碼子（ENC）作為偏好性參考標準，對53條CDS的ENC值進行從大到小的排序，從兩端各選擇10%的基因構建高低偏性庫，同時計算ΔRSCU（ΔRSCU=RSCU高表達-RSCU低表達）。在高低偏性庫中選擇ΔRSCU≥0.08的密碼子為高表達優越密碼子，將RSCU值大于1的密碼子確定為高頻密碼子，同時滿足高頻率密碼子和高表達優越密碼子的確定為最優密碼子。

2 結果與分析

2.1 密碼子偏性分析

53條CDS的GC平均含量（GCall）為37.21%，不同位置的GC含量為GC1（45.50%）＞GC2（37.85%）＞GC3（28.27%）（表1），密碼子第3位的GC含量明顯低于密碼子第1位、第2位的GC含量，而GC3可反映密碼子偏好性，表明柔毛郁金香葉綠體基因組的密碼子第3位堿基組成多為A和T。

ENC值是衡量同義密碼子使用偏度的重要指標，并與同義密碼子的偏性呈負相關，即ENC值越小，偏性越強，ENC值越大，偏性越弱［14］。柔毛郁金香葉綠體基因組中53條CDS的ENC值在38.82～62.28范圍內，平均值為48.52（表1）。不同CDS的同義密碼子偏倚程度不同，其中ENC＞45的共有41條，表明柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子偏好性較弱。根據ENC的理論取值范圍（20～61），ycf3基因ENC值為62.28，說明該基因的同義密碼子完全沒有偏倚。

從柔毛郁金香葉綠體基因組各基因參數（GC1、GC2、GC3、GCall、ENC值）的相關性分析（表2）可知，GCall與GC1、GC2、GC3的相關性均達到極顯著水平，GC3與GC1達到顯著水平，而與GC2未達到顯著水平，說明柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子第2位的堿基組成與第3位的堿基組成具有差異。ENC僅與GC3達到極顯著相關水平，而與GC1、GC2相關性均不顯著，表明柔毛郁金香的使用偏好性受GC1、GC2的影響不大，主要與GC3有關。密碼子數量與ENC的相關性未達到顯著水平，同時說明基因的序列長度對密碼子使用偏性無明顯影響。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖即堿基組成差異性分析，是初步判斷影響密碼子使用偏好性因素的方法之一［15］。通過分析GC12與GC3之間的關系，來判斷密碼子受到自然選擇和突變壓力的程度。各基因均落在對角線上方，且分布不均勻，說明柔毛郁金香的葉綠體基因組密碼子偏好性主要受自然選擇的影響（圖1-A）。柔毛郁金香的葉綠體基因組的密碼子中GC3介于0.19～0.36，而GC12介于0.31～0.55之間，回歸系數為0.3764，GC12與GC3的相關系數為0.279，說明2個變量間的相關性很弱（圖1-B）。

2.3 ENC-plot繪圖分析

ENC-plot分析通過ENC值和GC3分布的關系，對基因數據的密碼子偏好性進行圖像可視化來判[CM（21]斷自然選擇和突變壓力對密碼子偏好性的影響程度（圖2）。通過二維散點圖發現各散點未沿標準曲線均勻分布，離標準曲線有一定的距離。結合ENC比值頻數分布表（表3），49%的基因分布在 -0.05～0.05區間，與預期ENC值接近，主要受突變壓力的影響；此區間以外的51%的基因與預期ENC值存在一定差異，主要受自然選擇的影響。因此，柔毛郁金香葉綠體基因組中大部分密碼子的偏好性主要受自然選擇的影響。

2.4 PR2-plot 繪圖分析

根據密碼子第3位的A、T、C、G的含量判斷第3位A與T、C與G之間的線性關系，通過偏倚程度來判斷影響密碼子偏好性的主要因素。柔毛郁金香的葉綠體基因組中各基因在第一、二、三、四象限呈不均勻分布，主要集中分布在右下側且其他點與中心點的矢量距離較遠（圖3），說明柔毛郁金香葉綠體基因組第3位堿基在密碼子的使用上具有一定的偏好性，且密碼子中堿基的使用頻率Ggt;C、Tgt;A，其密碼子偏好使用T和G。表明柔毛郁金香葉綠體基因組的密碼子使用模式不僅受到突變壓力的影響，同時也受到自然選擇的影響。

2.5 最優密碼子

構建的高表達基因和低表達基因偏性庫中（表4），篩選到高頻密碼子（RSCUgt;1）共32個，其中以A或U結尾的密碼子有29個，以G結尾的有3個；篩選到高表達優越密碼子（ΔRSCU≥0.08）共19個。同時滿足RSCUgt;1且ΔRSCU≥0.08的共有17個密碼子，是柔毛郁金香葉綠體基因組的最優密碼子：GCU、CGU、AAU、CAA、GAA、GGU、AUA、AUU、UUA、AAA、UUU、CCU、AGU、UCU、ACU、GUA和GUU，均以A或U結尾。

3 討論與結論

葉綠體基因組具有一套獨立、完整的遺傳信息，且編碼區的基因序列相對保守，常用于植物的群體進化和系統發育關系研究［16］。而密碼子的使用模式是植物基因組的基本特征，會影響基因的功能與表達［17］，同時密碼子的使用頻率受多重因素的影響， 如基因表達水平、基因長度、tRNA豐度、突變偏倚和堿基組成等都會影響同義密碼子的使用偏性［18-19］。因此，植物葉綠體基因組密碼子偏好性的研究有助于明晰功能基因的堿基組成，從而更好地確定目的基因的功能［20］。本研究在柔毛郁金香葉綠體基因組中篩選出的53條CDS序列中有41條的ENC值大于45，ENC值越大，密碼子偏性越弱，表明柔毛郁金香的密碼子表現出較弱的偏好性。

在前人的研究結果中，定向突變壓力和自然選擇是影響密碼子使用偏性的重要因素，被廣泛用于解釋物種間密碼子使用的差異［21-23］。大多數的植物葉綠體基因組中，密碼子第3位通常比較保守，選擇壓力對其影響不大［24］。在本研究中密碼子第3位的GC含量明顯低于密碼子第1位、第2位的GC含量，所以，第3位的堿基組成多為A和T。結合PR2-plot繪圖分析，密碼子第3位的堿基使用頻率呈現Ggt;C、Tgt;A的規律。針對影響柔毛郁金香的葉綠體基因組密碼子的偏性因素進行多元統計分析，其密碼子使用模式不僅受到突變壓力的影響，同時也受到自然選擇的影響，在糜子（Panicum miliaceum L.）［25］、美麗梧桐（Firmiana pulcherrima）、云南梧桐（F.major）［26］、巨桉（Enculyptu sgrandis）［27］等植物的研究中也得到相同的結論。結合ENC比值的頻數分布，51%的基因實際ENC值與預期ENC值存在一定差異，認為自然選擇的作用對柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子的影響更大。

最優密碼子的確定可進行基因表達載體設計，提高目的基因的表達量［28］，為分子輔助育種提供參考依據。本研究結合柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子的使用偏好模式，篩選到17個最優密碼子，符合高等植物最優密碼子NNA和NNU的模式［29-30］。同時密碼子偏好性分析可輔助研究野生種質資源適應外界環境的分子機制，我國有豐富的野生郁金香種質資源，是育種的重要基礎材料。因此，后續須加快對郁金香屬其他野生種質資源的偏好性研究，以確定屬間不同種植物偏好性差異的因素是否一致，為郁金香屬植物種質資源的開發與利用提供理論支撐。

本研究以柔毛郁金香的53條蛋白編碼序列（CDS）為研究對象，對密碼子使用偏好模式進行預測并篩選到17個最優密碼子，闡明了柔毛郁金香葉綠體基因組密碼子使用模式及偏好性。研究結果可為后續開展郁金香葉綠體基因工程、野生郁金香種群演化及系統分類以及發育研究奠定基礎。

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收稿日期：2023-02-21

基金項目：中國科學院“西部之光”項目［編號：中科人字（2022）4號］；青海省“昆侖英才”科技領軍人才培養項目［編號：青人才字（2022）1號］。

作者簡介：秦斗文（1996—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從觀賞植物遺傳育種研究。E-mail：qindouwen@163.com。

通信作者：巨秀婷，碩士，副教授，主要從事觀賞植物遺傳育種研究。E-mail：juxiuting@163.com。