青稞內生細菌RKZ-05對禾谷鐮刀菌的拮抗作用及其分子鑒定

摘要：由禾谷鐮刀菌復合種引起的小麥赤霉病和鐮刀菌毒素污染嚴重影響小麥的產量和質量。從山南、日喀則、林芝3個地區的青稞中篩選出對禾谷鐮刀菌具有較好拮抗作用的菌株，為赤霉病病害及毒素污染控制提供生物防治菌株資源，同時為高原地區植物內生菌的資源開發提供參考。從青稞樣品中分離篩選出對禾谷鐮刀菌具有較好生防效果的菌株RKZ-05，經過形態學鑒定、生理生化特征分析和分子生物學鑒定分析，明確其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。利用平板對峙法分析其抑菌譜范圍，隨后對RKZ-05無菌發酵液的抑菌控毒效果進行分析，發現其能顯著抑制禾谷鐮刀菌菌絲生長和DON毒素合成。通過對拮抗物質合成相關基因的擴增，確定該菌具有生防相關的 3 個合成基因——桿菌霉素 D 合成相關基因 bamC、豐原素合成相關基因 fenB 以及桿菌溶素合成相關基因 bacAB，預測該菌株可以合成桿菌霉素 D 、豐原素及芽孢桿菌溶素3種拮抗物質。菌株RKZ-05除了對禾谷鐮刀菌具有較好的拮抗性，還對其他多種病原真菌具有明顯抑制作用，說明該菌株具有廣譜的拮抗能力。

關鍵詞：禾谷鐮刀菌；青稞；內生細菌RKZ-05；拮抗作用；分子鑒定；生防效果

中圖分類號：S182；S435.121.4+5 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0113-08

小麥赤霉病是影響小麥健康的重要真菌病害，它是以禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為主的多種鐮刀菌復合侵染所致［1］，容易受氣候等多方面因素影響。小麥赤霉病在我國發病率不斷上升，長江中下游和江淮地區是高發地區，在最嚴重的年份，25%的種植區域會受到影響，引起重大經濟損失［2］。赤霉病的發生不僅嚴重影響小麥的產量，而且在病害侵染過程中會產生多種有毒次生代謝產物，如脫氧雪腐鐮刀烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），這類生物毒素會直接存留、累積在籽粒中，嚴重影響谷物質量安全，對人類健康產生危害［3］。其中屬DON毒素污染范圍最大，污染情況最為嚴重。在生產上，化學藥劑防控是控制病害和鐮刀菌毒素產生的最有效措施之一［4］。但長期使用化學農藥不僅嚴重威脅環境生態健康，還會導致禾谷鐮刀菌抗性菌株大量出現，有時還會刺激鐮刀菌毒素的合成與積累，加劇毒素污染等問題［5］。因此，探尋針對小麥赤霉病及禾谷鐮刀菌毒素的生物防治措施，對保障小麥質量安全意義重大［6］。近年來，以特異性抑菌效果的微生物或其衍生物為核心的生物防治措施日益受到關注，其中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬及鏈霉菌屬等是最為常見的生防菌，他們具有顯著的防治赤霉病能力［7］。而芽孢桿菌屬是研究最多的生防菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefacien）等對禾谷鐮刀菌都有一定的抑制作用。生物防治具有對環境沒有污染、不容易產生抗性且對人畜危害較低的優勢，因此篩選出對禾谷鐮刀菌具有拮抗效果的菌株，并研制出新的生防菌劑已成為人們日漸關注的重點。

植物內生菌（endophyte）存在于植物器官或組織的細胞或細胞間隙中，對宿主植物的正常生長和植株健康不會產生影響［8］，并且已有研究發現大部分的內生菌具有促進植物生長和增加對病害、逆境的抵抗力等作用。此外，內生菌還可以分解有毒物質［9］。青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，一般也可稱為裸大麥、米麥和元麥，其在成熟時籽粒內外稃與穎果分離，籽粒裸露［10］。青稞具有成熟期短、耐寒性強等生長特性，在我國主要種植區域為西藏自治區和青海省全境及甘肅省、四川省和云南省的局部地區，是高原地區主要的糧食作物之一［11］。由于青稞特殊而極端的生長條件，其內生細菌的作用仍然未被充分發掘。本研究以山南、日喀則及林芝3地的青稞籽粒內生菌為來源，篩選出對禾谷鐮刀菌具有較好生防效果的菌株RKZ-05；進一步對該菌株進行研究，分析其形態學、生理生化特征和分子生物學基因序列特征，并對其抑菌譜和抑菌控毒效果進行研究，以期為抑菌機制研究和菌劑開發提供理論基礎，同時為高原地區植物內生菌的資源開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：擬枝孢鐮刀菌 （Fusarium sporotrichiodies）、梨孢鐮刀菌（F. poae）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）、藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）、輪枝鐮刀菌（F. verticillioides）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、厚垣鐮刀菌（F. chlamydosporum）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）及鏈格孢菌（Alternaria alternate）。以上菌株由江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所分離并置于50% 甘油中，-80 ℃ 保存。

培養基：LB 培養基/培養液（Luria-Bertani培養基/培養液），用于細菌菌株的分離和擴繁；PDA培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基），用于真菌菌株的生長及抑菌譜的測定；綠豆湯培養基，用于誘導禾谷鐮刀菌分生孢子的產生［12］；TBI培養基（單端孢霉烯生物合成誘導培養基），用于誘導禾谷鐮刀菌DON毒素的合成［13］。

試劑盒：細菌DNA提取試劑盒（FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit，諾唯贊，DC103-01）；革蘭氏染色試劑盒（Gram Staining Kit索萊寶，G1060）；芽孢桿菌生理生化分析試劑盒（HiBacillusTM Identification Kit，HiMedia Laboratories，KB-013）。

1.2 青稞內生拮抗細菌的分離

2022年7月在西藏地區收集青稞籽粒，并帶回江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所完成后續試驗。以禾谷鐮刀菌標準菌株PH-1為篩選菌株，分離青稞內生拮抗細菌。取75% 乙醇消毒后的青稞籽粒10 g于無菌粉碎機中，加入 90 mL 無菌水充分研磨并梯度稀釋，取106倍稀釋后的 100 μL稀釋液涂布于LB平板上，37 ℃倒置培養 24 h。待上述平板長出菌落后，均勻噴灑 PH-1 的孢子液（105 個/mL）到平板上，待表面干燥后放入 37 ℃ 培養箱，倒置培養 24 h。挑選可產生抑菌圈的菌落進行復篩，統計抑菌圈產生情況，選擇拮抗作用較好的菌株進行進一步分析。

1.3 菌株RKZ-05形態學及生理生化鑒定

取分離純化完成的菌株在 LB 培養基上進行平板劃線，37 ℃培養 24 h 后觀察菌落形態。取單菌落接種于LB液體培養基中，37 ℃搖床培養 24 h后收集菌液，2 000 r/min 離心 15 min后棄上清，收集菌體，經戊二醛固定細胞形態，乙醇梯度脫水后，在電子顯微鏡（EVO-LS10，ZEISS，Jena，Germany）下觀察其微觀形態。使用試劑盒進行革蘭氏染色、甲基紅試驗、V-P試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗、糖醇類發酵試驗和耐鹽試驗等生理生化試驗。

1.4 菌株RKZ-05的分子生物學鑒定

以菌株 RKZ-05 的基因組 DNA 為模板，擴增16S rDNA及gyrB基因并進行T-A克隆，隨后送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序，引物序列見表1。根據測序結果，在 NCBI 網站下載相關序列，用 ClustalX 1.83 軟件進行比對，之后利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹。

1.5 菌株RKZ-05抑菌譜測定

采用皿內對峙的方式，在PDA雙層平板中央分別接入 5 mm 大小的鐮刀菌屬及其余病原真菌的菌餅，在距平板中心 25 mm 處的4點放置牛津杯，隨后在牛津杯中加入100 μL搖床培養 24 h 的 RKZ-05 的菌液，25 ℃培養 3～5 d，測量牛津杯邊緣至真菌菌落邊緣的距離，即抑菌帶寬度。每個處理重復 3 次。

1.6 菌株RKZ-05無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌控毒作用分析

取LB培養液中搖床培養 24 h 的 RKZ-05 菌液（1×109 CFU/mL），菌液經12 000 r/min 離心 15 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，由此獲得無菌發酵液。在 PDA 培養基中加入無菌發酵液，搖勻后配制成終濃度為10%、20%和50%的培養基，倒板后接種禾谷鐮刀菌，25 ℃培養 3 d，以添加 LB 培養基為空白對照，3 d 后測量菌落直徑。

接種1 mL禾谷鐮刀菌分生孢子（1×105個/mL）于含有10%、20%、50%無菌發酵液的30 mL TBI 培養基中，以空白 TBI 培養基為對照，25 ℃避光培養 7 d 后用滅菌紗布過濾收集菌絲和2 mL濾液，菌絲烘干并稱質量，濾液進行氮吹，隨后用1 mL甲醇復溶，過0.22 μm有機相濾膜后采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）測定 DON 毒素含量并計算單位菌絲的產毒量［13-14］。

1.7 拮抗基因預測

以菌株 RKZ-05 的基因組 DNA 為模板，PCR擴增已報道的抗菌物質合成相關基因［15］，包括伊枯草菌素（iturin）合成基因 ituC、桿菌霉素 D（bacillomycin D）合成基因 bamC、豐原素（fengycin）合成基因 fenB、芽孢桿菌表面活性素（sufaction）合成基因 sfp、羊毛硫類抗菌物質（ericin）合成基因 esiSa、芽孢桿菌溶素（bacilysin）合成基因 bacAB。引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 青稞內生拮抗菌的篩選

經過初篩和復篩，從山南、日喀則及林芝3地的青稞籽粒中共篩選到26株對禾谷鐮刀菌具有拮抗效果的內生菌，抑菌圈寬度范圍為2～10 mm，其中RKZ-05的拮抗作用較為明顯，分生孢子抑菌圈寬度為（8.35±0.11） mm（圖1）。

2.2 菌株RKZ-05的形態學及生理生化分析

菌株RKZ-05在LB培養基上形成了不透明、乳白色的菌落，邊緣具有不規則性，表面較為平滑，無褶皺。在革蘭氏染色試驗中菌體被染成藍紫色，說明其為陽性菌。其電鏡照片表明菌體呈桿狀，長度為1.0～2.0 μm。生理生化結果表明，菌株 RKZ-05 可以利用甘油、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、阿拉伯糖、海藻糖，丙二酸試驗、檸檬酸鹽利用反應和精氨酸脫羧反應等試驗為陰性，V-P反應、ONPG反應呈陽性（圖2、表2）。

2.3 菌株RKZ-05的分子生物學鑒定

以提取的RKZ-05的DNA為模板，分別擴增16S rDNA以及gyrB基因序列，得到1 600 bp左右的條帶并進行測序。將測序結果在NCBI 數據庫進行比對（圖3），結果表明拮抗菌株 RKZ-05 的16S rDNA 核酸序列與多株芽孢桿菌屬菌株的同源性較高，初步鑒定為芽孢桿菌屬。隨后對芽孢桿菌鑒定基因gyrB進行擴增，獲得1 450 bp左右的片段并在NCBI 數據庫進行比對（圖3），結果發現RKZ-05的[CM（21]gyrB基因序列與多株貝萊斯芽孢桿菌相似性較高，但未發現處于同一分支的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis，圖4），根據其生理生化及形態學特征，鑒定菌株RKZ-05為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4 菌株RKZ-05的抑菌譜分析

平板對峙試驗結果（圖5） 表明，菌株 RKZ-05 對多種植物病原真菌都具有明顯的抑制作用，其中對鐮刀菌屬中的梨孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌及禾谷鐮刀菌抑菌效果較好，抑菌帶寬度范圍為 4～6 mm；對擬枝孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和亞洲鐮刀菌抑制效果較差；對其他病原真菌中的稻瘟病菌的抑菌效果最好，抑菌帶寬度達 8 mm 左右；對大麗輪枝菌、灰葡萄孢及黑附球菌抑菌效果較差，抑菌帶寬度均小于3 mm。

2.5 菌株RKZ-05無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌控毒作用分析

由圖6可以看出，菌株RKZ-05的無菌發酵液能顯著抑制禾谷鐮刀菌 PH-1 菌絲的生長，20%濃度處理下菌絲生長抑制率達 45%，50%濃度無菌發酵液處理下菌絲生長抑制率達62%（圖6-A、圖 6-B）。 進一步分析無菌發酵液對 DON 毒素產生的影響，結果發現其能顯著抑制毒素的合成，10% 濃度無菌發酵液處理后菌絲中DON毒素的含量較對照降低了79%，當無菌發酵液濃度達50%時，菌絲中DON毒素的含量為0（圖6-C）。

2.6 菌株RKZ-05拮抗物質基因的鑒定

以RKZ-05的DNA為模板，PCR擴增拮抗物質合成相關基因，結果發現幾種常見抗菌脂肽類物質合成基因，例如桿菌霉素D合成相關基因bamC、豐原素合成相關基因fenB以及桿菌溶素合成相關基因bacAB被成功擴增（圖7）。由此推測，菌株RKZ-05的拮抗產物中可能包含桿菌霉素D、豐原素及芽孢桿菌溶素， 但具體的拮抗物質還需進一步的分離純化和鑒定。

3 討論

植物內生菌物種極為豐富，主要包括真菌、細菌和放線菌三大類，由于其能夠產生豐富多樣的具有農藥活性的次生代謝產物，在植物病害生物防治方面發揮著巨大作用［16］。我國藏區居民主要食糧、燃料和牲畜飼料——青稞主要分布于我國西北和西南各省，適宜生長于高原清涼氣候環境中，因此對于青稞內生微生物資源的研究具有廣闊的探索和發展前景。本研究從山南、日喀則及林芝3地的青稞籽粒中分離篩選出26株內生菌，并從中挑選出1株對禾谷鐮刀菌具有較好拮抗效果的細菌RKZ-05，通過16S rDNA和 gyrB基因序列鑒定，顯示其為貝萊斯芽孢桿菌。此外，菌株RKZ-05不僅對禾谷鐮刀菌有一定的拮抗效果，還對多株鐮刀屬真菌及多株常見病原真菌均具有拮抗效果，這表明該菌株抑菌范圍較廣，對多種真菌病害防治均具有一定療效。

貝萊斯芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬的一個新種，由于其具有廣譜抑菌活性和促生長作用，在生物防治、醫療醫藥、食品加工和化能化工等方面具有重要作用［17］。近些年國內外利用貝萊斯芽孢桿菌進行生物防治的研究報道不斷涌出，主要體現在協同植物生長、拮抗病原菌、誘導產生系統抗性和分泌抑菌物質等方面。沙月霞等從水稻葉片中分離出能抑制稻瘟病病菌菌絲生長的貝萊斯芽孢桿菌E69，并明確其具有廣譜的抑菌活性［18］；宗英等從感染赤霉病的麥穗上篩選到 1 株可高效抑制禾谷鐮刀菌的貝萊斯芽孢桿菌 JS25R［19］；劉雪嬌等分析了貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15 對由尖孢鐮刀菌引起的大豆根腐病的生防作用和促生機理［20］；Wambacq等評估了NRRL B-23189對青霉菌株的拮抗作用［21］。本研究發現，貝萊斯芽孢桿菌菌株 RKZ-05 能夠抑制禾谷鐮刀菌菌落生長，10%的無菌發酵液處理后能顯著抑制菌絲生長和DON毒素的產生，表明其具備防治由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病病害的潛力，同時亦能降低小麥鐮刀菌毒素污染，但其具體的防治效果還需進一步的田間試驗驗證。

已有研究報道，芽孢桿菌能夠產生表面活性素、伊枯草菌素等多種拮抗類物質，破壞病原菌的細胞膜，引起細胞內物質外滲，從而達到抑制病原真菌生長的作用［22］。貝萊斯芽孢桿菌主要通過分泌脂肽類抗生素、聚酮類化合物［23-25］和抗菌蛋白等［26］產生抑菌作用。Chowdhury 等研究發現，貝萊斯芽孢桿菌菌株FZB42 能夠產生表面活性素、豐原素和桿菌霉素D等物質，能夠改變立枯絲核菌的菌絲體和分生孢子的細胞壁以及細胞質膜的形態，抑制病原菌的生長［27］。Gao等研究發現，貝萊斯芽孢桿菌菌株V4能夠產生伊枯草菌素、大環內酰亞胺A和地非西丁等抗菌物質，可以影響殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）的細胞膜完整性，引起菌體死亡［28］。Thurlow等分析貝萊斯芽孢桿菌AP193菌株的拮抗機制，發現其中關鍵的次級代謝產物是聚酮類化合物地非西丁，且缺失表達相關基因dfnD后失去對番茄細菌性斑點病的防控效果［29］。本研究中通過對RKZ-05的拮抗物質合成相關基因進行擴增，初步預測其拮抗產物中可能包含桿菌霉素D、豐原素及芽孢桿菌溶素，但是具體物質種類還需要通過后續試驗來進一步的分析和鑒定。

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收稿日期：2023-01-13

基金項目：西藏自治區重點研發計劃 （編號：XZ202001ZY0038N）；農業農村部農產品質量安全風險評估項目（編號：GJFP20220102）；江蘇省農業科技自主創新資金［編號：CX（21）1005］。

作者簡介：周 萍（1999—），女，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事生物防治相關工作。E-mail：1844547274@qq.com。

通信作者：高 弢，博士，副研究員，主要從事鐮刀菌毒素綠色防控相關工作，E-mail：gaotao8806@jaas.ac.cn；仇劍波，博士，副研究員，主要從事農產品質量安全方面的研究，E-mail：qiujianbo@jaas.ac.cn。