OsOFP6基因過表達(dá)與RNA干擾水稻轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：為探究卵形家族蛋白6（OFP6）基因過表達(dá)（OE）與RNA干擾（RNAi）對水稻基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，并解析OsOFP6基因調(diào)控水稻生長發(fā)育與抗逆通路，對OsOFP6基因的OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）測序。測序共獲得446 277 340份原始數(shù)據(jù)，每個樣品比對率均在90.84%以上，OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi共檢測到22 116個基因，以Fold Change≥2且FDRlt;0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，ZH11 vs OsOFP6-OE中獲得229個差異表達(dá)基因（DEGs），其中包含上調(diào)基因161個、下調(diào)基因68個；ZH11 vs OsOFP6-RNAi中獲得1 466個差異表達(dá)基因，其中包含上調(diào)基因464個、下調(diào)基因1 002個。OsOFP6-OE的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異基因在氨基酸糖和核苷酸糖代謝相關(guān)通路中較多。OsOFP6-RNAi的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異基因顯著富集于核糖體相關(guān)通路。過表達(dá)OsOFP6后，顯示有8個DEGs富集到核氨基酸糖和核苷酸糖代謝通路中，可能參與核苷酸與蛋白質(zhì)的水解。OsOFP6-RNAi后，其中有28個DEGs被富集到核糖體中，可能參與mRNA的翻譯、翻譯共折疊、添加不依賴翻譯的氨基酸。利用RNA-Seq技術(shù)分析了OsOFP6基因過表達(dá)與RNA干擾對中花11的影響，發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)控多個OsOFP6下游基因表達(dá)，來影響其代謝相關(guān)信號通路，為后續(xù)分析OsOFP6基因的功能以及解析OFP家族基因的表達(dá)調(diào)控提供了材料。

關(guān)鍵詞：水稻；OsOFP6基因；核糖體；代謝；RNA-seq；差異表達(dá)基因

中圖分類號：S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0024-10

卵形家族蛋白（OFPs）作為一種新型的植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中具有多種功能。第一個OVATE基因被鑒定為控制番茄果實性狀的主要數(shù)量性狀位點（QTL）［1］，OVATE蛋白由70個氨基酸組成。隨后，該結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)為植物蛋白所獨有，并被命名為OVATE結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白被命名為OVATE家族蛋白［2］。功能研究表明，擬南芥中OFPs（AtOFPs）在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的多個方面起作用，如葉的發(fā)育和小花的形狀。蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)分析結(jié)果表明，AtOFPs與植物發(fā)育的其他基本調(diào)控因子（如TALE同源主蛋白）具有密切的功能聯(lián)系［3］。例如，AtOFP1與TALE蛋白的成員BLH1相互作用，這種相互作用導(dǎo)致BLH1從細(xì)胞核重新定位到細(xì)胞質(zhì)空間［4］。據(jù)報道，AtOFP1和AtOFP4被認(rèn)為是含有BLH6與KNAT7的多蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物的組成部分，用于調(diào)節(jié)次級細(xì)胞壁的形成［5］。AtOFP5通過抑制BELL-KNOX TALE復(fù)合物的活性，調(diào)節(jié)擬南芥胚囊的發(fā)育。

水稻（Oryza sativa）作為全球主要作物，提供了世界人口21%以上的熱量需求和東南亞人口76%的熱量攝入。在我國約有60%的人口以稻米為主糧，水稻成為最重要的直接經(jīng)濟(jì)作物之一，近年來，為了幫助應(yīng)對氣候變化和人口增長所帶來的影響，人們在培育抗壓力和產(chǎn)量穩(wěn)定的水稻品種上投入了大量精力。雖然許多基因在水稻抵御非生物脅迫方面的功能已經(jīng)被研究過［6-7］，由于控制非生物應(yīng)激反應(yīng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，所涉及的機(jī)制仍然難以捉摸。鑒于其在植物生長發(fā)育的多個方面的功能，OFPs值得研究。水稻全基因組分析結(jié)果顯示，有31個典型的OsOFPs基因［8］，亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，大部分OsOFPs蛋白定位在細(xì)胞核，少數(shù)蛋白以點狀形式分布在細(xì)胞質(zhì)中。時空表達(dá)分析結(jié)果表明，大多數(shù)OsOFPs基因的表達(dá)在組織中無特異性，在各個組織中均有表達(dá)［9-13］。OFPs基因在植物中分布廣泛，對不同植物OFPs的功能研究表明，OFPs參與植物生長發(fā)育的多個方面的調(diào)控，可能是通過與不同類型的轉(zhuǎn)錄因子相互作用或直接調(diào)控目的基因（如GA20ox），調(diào)節(jié)包括果實成熟、形狀與品質(zhì)、胚珠發(fā)育以及非生物脅迫等在內(nèi)的多種生物過程［5，14-17］，但它們在調(diào)控生長發(fā)育以及應(yīng)對非生物脅迫中的具體作用通路在很大程度上仍是未知的。因此，挖掘克隆與水稻理想株型建成以及能夠抵御逆境脅迫的相關(guān)基因，并研究其功能，為水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

筆者所在實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，敲除OsOFP6基因后植株半矮化，籽粒形狀發(fā)生變化，側(cè)根變短；在干旱條件下，與RNAi植株相比，過表達(dá)株系失水較慢，H2O2積累較少，在低溫處理下，過表達(dá)較RNAi株系表現(xiàn)出較低的相對電導(dǎo)率（REC），表明OsOFP6可以調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，其過表達(dá)株系具有抗寒性和抗旱性［17］。

本研究以筆者所在課題組前期通過過表達(dá)與RNA干擾技術(shù)構(gòu)建成功的OsOFP6-OE/中花11、OsOFP6-RNAi/中花11和野生型中花11為試驗對象，在水稻灌漿期采集新鮮葉片進(jìn)行RNA-Seq分析，篩選野生型中花11與OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi的差異表達(dá)基因，分析相關(guān)功能，為進(jìn)一步解析OsOFP6基因調(diào)控植物生長發(fā)育路徑與抗逆機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗材料選自梗稻品種中花11（ZH11），課題組前期利用過表達(dá)與RNAi技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株。植物材料于2020年3—7月種植于廣州華南植物園的試驗田中。水稻播種前經(jīng)2%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒20 min，利用蒸餾水沖洗干凈后浸種催芽，種子露白后種植于試驗田中，當(dāng)水稻生長至灌漿期，采摘ZH11與轉(zhuǎn)基因植株新鮮的葉片并迅速置于液氮中冷凍，儲存在-80 ℃直到總RNA提取，每個樣本均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，共9個樣本，將其分別編號為BZH11-1、BZH11-2、BZH11-3、OE6-1、OE6-2、OE6-3、RNAi6-1、RNAi6-2、RNAi6-3。

1.2 主要試劑及儀器

RNAsimple總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、SYBR Green試劑盒購自諾唯贊生物科技（南京）有限公司；qTOWER3G IVD實時熒光定量儀購自耶拿儀器分析（北京）有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析

1.3.1 RNA-Seq測序 采摘9個試驗樣本送至北京百邁客生物科技股份有限公司，對其提取總RNA、構(gòu)建cDNA文庫、進(jìn)行高通量測序，使用Illumina測序平臺測序樣品。

1.3.2 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控 采用FastQC對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，將含有接頭的、低質(zhì)量的讀數(shù)去除后，得到高質(zhì)量的干凈讀數(shù)。

1.3.3 干凈讀數(shù)分析 參考基因組和注釋文件分別采用來自HISAT2 2.0.4的高效比對系統(tǒng)，利用StringTie進(jìn)行組裝和定量。對于有生物學(xué)重復(fù)的樣本通過DESeq2 1.6.3進(jìn)行樣品組間差異表達(dá)分析，獲取ZH11 vs OsOFP6-OE與ZH11 vs OsOFP6-RNAi的差異表達(dá)基因集；無生物學(xué)重復(fù)的樣本，則使用edgeR 3.8.6進(jìn)行差異分析，將Fold Change≥2且FDRlt;0.05作為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 差異表達(dá)基因的層次聚類和KEGG通路富集分析 利用R包進(jìn)行火山圖與熱圖的繪制，顯示差異表達(dá)基因的分布以及在ZH11、OsOFP6-OE與 OsOFP6-RNAi的葉片中的表達(dá)；由檢測到的FPKM值，對樣品進(jìn)行主成分分析（PCA）。對其進(jìn)行相關(guān)性檢測后，KEGG通路富集分析差異表達(dá)基因，根據(jù)Fold-enrichment和調(diào)整后的P值，對與OsOFP6互作的基因進(jìn)行篩選。

1.4 實時熒光定量PCR驗證差異表達(dá)基因

依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選取7個差異表達(dá)基因，通過實時熒光定量PCR方法對RNA-Seq測序結(jié)果進(jìn)行驗證。使用RNA Isolater提取水稻灌漿期的新鮮葉片總RNA，使用NanoDropTM One/OneC 微量 UV-Vis 分光光度計檢測RNA濃度，檢測RNA完整性后，使反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。選用 β-acti （LOC_Os11g06390）作為內(nèi)參基因，使用SnapGene 4.3.6軟件選擇目的基因Genomic Sequence區(qū)來設(shè)計引物，引物信息見表1。反應(yīng)體系20 μL，參照諾唯贊的SYBR Green試劑盒使用說明。每個試驗樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計分析

組間采用t檢驗分析差異性，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以α=0.01與α=0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，利用Excel進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與比對

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析ZH11、OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi的總RNA，結(jié)果見表2。9個樣品測序共獲得446 277 340份原始數(shù)據(jù)，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)，可進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2.2 差異表達(dá)基因分析

利用RNA-Seq測序共鑒定到22 116個基因，ZH11與OsOFP6-OE相比較，篩選到229個差異表達(dá)基因（DEGs），其中161個基因上調(diào)表達(dá)，68個基因下調(diào)表達(dá)；而 ZH11與OsOFP6-RNAi比較，篩選到1 466個差異表達(dá)基因，其中464個基因上調(diào)表達(dá)，1 002個基因下調(diào)表達(dá)（圖1-a、圖1-b、圖1-f），表明OsOFP6-OE對許多基因有負(fù)調(diào)控作用，而OsOFP6-RNAi對不少基因有正調(diào)控作用。圖1-c、圖1-d的熱圖表示了差異表達(dá)基因的表達(dá)量分布情況。圖1-e的韋恩圖展示了ZH11 vs OsOFP6-OE和ZH11 vs OsOFP6-RNAi中所有的DEGs關(guān)系，ZH11 vs OsOFP6-OE與ZH11 vs OsOFP6-RNAi存在100個相同的差異表達(dá)基因。3組樣品組內(nèi)均一性較好，但OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi的基因表達(dá)量均與ZH11相比較差異顯著，表明OsOFP6基因可顯著誘導(dǎo)或抑制水稻生長過程中大量基因的表達(dá)。

2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

2.3.1 差異表達(dá)基因的GO富集分析 測序獲得的1 466個DEGs的GO集分析結(jié)果表明，共有 1 422 個DEGs被注釋到GO數(shù)據(jù)庫中，可將其分為生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3個GO一級功能類別。在ZH11 vs OsOFP6-OE中，203個DEGs注釋為生物過程、細(xì)胞成分和分子功能對應(yīng)的GO二級功能組的數(shù)量分別為19、13、10個（圖2-a），在ZH11 vs OsOFP6-RNAi中，1 292個DEGs注釋為生物過程、細(xì)胞成分和分子功能對應(yīng)的GO二級功能組的數(shù)量分別為20、13、12個（圖2-b）。表明OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi中大多數(shù)DEGs在生物過程中富集，且主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程、單一生物體過程中；OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi參與細(xì)胞成分的差異基因均主要富集于細(xì)胞、細(xì)胞部分；在分子功能中，OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi的DEGs主要涉及催化活性和結(jié)合2個方面。GO[CM（20*2]功能聚類結(jié)果表明，水稻在OsOFP6-OE和OsOFP6-RNAi中經(jīng)歷了非常復(fù)雜的生長發(fā)育過程。涉及細(xì)胞過程、代謝過程、單一生物體過程等生物學(xué)功能的基因相對活躍。進(jìn)一步表明，這些功能途徑可能通過一些細(xì)胞調(diào)節(jié)途徑，如加工和代謝途徑，對刺激和生物調(diào)節(jié)作出反應(yīng)，從而使水稻響應(yīng)外界環(huán)境的變化與葉夾角的調(diào)節(jié)過程。

2.3.2 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，共有424個DEGs被注釋為KEGG一級分支（14個DEGs同時富集于OsOFP6-OE和OsOFP6-RNAi）（圖3）。在OsOFP6-OE中，52個DEGs主要注釋在30個KEGG二級分支，在氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、二萜類化合物的生物合成中較多（圖 3-a），而在OsOFP6-RNAi中，有386個DEGs主要注釋到KEGG的49個二級分支，在核糖體、氨基酸糖和核苷酸糖的代謝中分布較多（圖3-b）。

差異表達(dá)基因KEGG富集分析散點圖的結(jié)果表明，ZH11與 OsOFP6-OE相比較（圖4-a），植株中的DEGs主要參與氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、二萜類化合物的生物合成以及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的代謝、MAPK信號傳導(dǎo)途徑-植物、精氨酸[CM（21]和脯氨酸的代謝途徑與水稻生命活動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有一定的相關(guān)性，其中氨基酸糖和核苷酸糖代謝、MAPK信號傳導(dǎo)途徑-植物、精氨酸和脯氨酸的代謝途徑中，基因均上調(diào)表達(dá)。二萜類化合物的生物合成以及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中基因包含上調(diào)基因和下調(diào)基因。這些結(jié)果表明，OsOFP6-OE可能通過調(diào)節(jié)氨基酸糖和核苷酸糖的代謝參與植物激素信號通路以增強(qiáng)水稻抗逆性，而KEGG途徑中的其他基因大多下調(diào)表達(dá)，這可能與遺傳信息處理和代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的整體變化有關(guān)，從而調(diào)節(jié)蛋白激酶的合成和活性等，來增強(qiáng)水稻的抗逆性。ZH11與OsOFP6-RNAi相比較，DEGs主要富集在α-亞麻酸代謝、核糖體以及角質(zhì)素、軟木脂和蠟質(zhì)的生物合成、亞油酸代謝、氨基酸糖和核苷酸糖代謝途徑中，這些途徑可能主要參與植株形態(tài)建成，其中角質(zhì)素、軟木脂和蠟質(zhì)的生物合成中， 基因均下調(diào)表達(dá)， 其他4條通路中的DEGs中包含上調(diào)基因和下調(diào)基因。OsOFP6-RNAi中部分基因的表達(dá)量見表3。這可能表明，OsOFP6-RNAi中的這些基因主要參與水稻生長調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞調(diào)節(jié)和酶活性，調(diào)控植株細(xì)胞的生長與增殖，從而調(diào)節(jié)水稻葉夾角。進(jìn)一步分析表明，OsOFP6-OE和OsOFP6-RNAi的KEGG途徑中均存在氨基酸糖與核苷酸糖代謝途徑，表明氨基酸[CM（21]糖與核苷酸糖代謝途徑與水稻抗逆性、葉夾角的影響因素密切相關(guān)。

2.4 差異表達(dá)基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證

從OsOFP6-OE中隨機(jī)選擇3個差異表達(dá)基因LOC_Os05g33130、LOC_Os08g40680、LOC_Os10g39680，從OsOFP6-RNAi中隨機(jī)選擇4個差異表達(dá)基因T62、UbL401、UbL404、UbL402，用RT-PCR驗證測序數(shù)據(jù)。由圖5可知，OsOFP6-OE與中花11相比，葉片中LOC_Os05g33130、LOC_Os08g40680、LOC_Os10g39680基因表達(dá)量極顯著下調(diào)（Plt;0.01），OsOFP6-RNAi與中花11相比，葉片中T62、UbL401、UbL404、UbL402基因表達(dá)量極顯著上調(diào)（Plt;0.01），這與RNA-Seq測序結(jié)果一致，表明RNA-Seq測序結(jié)果可靠。

3 討論與結(jié)論

OVATE家族蛋白是植物特異性調(diào)控蛋白［4］。OsOFPs的功能研究表明，它們通過植物激素信號通路調(diào)節(jié)顆粒形狀、植物結(jié)構(gòu)和葉片角度。OsOFP6已被證明可以調(diào)節(jié)水稻株高、籽粒形狀以及非生物脅迫反應(yīng)。

為了更好地了解OsOFP6基因?qū)λ究鼓嫘砸约叭~夾角的潛在分子機(jī)制，對ZH11與OFP6過表達(dá)、OFP6干擾進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，建立了9個測序文庫，確定了22 116個潛在基因。此外，OFP6過表達(dá)的229個差異基因與OFP6干擾的1 466個差異基因顯著富集在幾個GO和KEGG通路中，這些通路涉及抗逆與葉夾角調(diào)節(jié)機(jī)制，包括氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、二萜類化合物的生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些途徑進(jìn)一步證實OsOFP6基因可調(diào)控下游基因的表達(dá)，并提高水稻的抗逆性與調(diào)節(jié)葉夾角。

3.1 OsOFP6基因負(fù)向調(diào)控水稻葉角大小

研究表明，水稻葉夾角受多種因素調(diào)控，一般分為激素途徑和非激素途徑兩大類。油菜素內(nèi)脂（BR）等激素以及與之相關(guān)的各種響應(yīng)因子共同調(diào)控水稻葉夾角的大小；非激素途徑，如ILA1突變體中厚壁細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞壁中木聚糖、纖維素含量降低，均減弱了葉枕的機(jī)械支撐作用，導(dǎo)致葉夾角增大［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，ZH11 vs OsOFP6-RNAi編碼木聚糖酶抑制劑基因OsHI-XIP（LOC_Os06g51050）發(fā)生上調(diào)表達(dá)。

筆者所在實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，OsOFP6-RNAi植株相較于野生型ZH11葉角增大，但對BR 的響應(yīng)與ZH11一致，表明OsOFP6通過非BR途徑調(diào)控水稻葉夾角大小［13，20］。已有研究表明，OsOFP1、OsOFP8、OsOFP19均通過BR途徑調(diào)節(jié)水稻葉夾角，這表明OsOFPs可以通過激素或非激素途徑調(diào)控水稻株型［9，21-22］。

3.2 OsOFP6基因通過生長素途徑影響水稻側(cè)根發(fā)育

生長素調(diào)控植物根系發(fā)育［23-25］。AUX/LAX是主要的生長素轉(zhuǎn)運載體，例如AUX1與LAX3在水稻側(cè)根的發(fā)育中扮演著重要角色［26-27］。而生長素極性運輸抑制劑結(jié)合蛋白可與生長素極性運輸抑制劑N-1-氨甲酰苯甲酸萘酯（NPA）結(jié)合，阻礙生長素的運輸，外源施用NPA，會抑制生長素的極性運輸與根系發(fā)育、延遲不定根原基出現(xiàn)［27］。

已有研究表明，OsOFP6 基因在幼根、側(cè)根中的表達(dá)量較高，OsOFP6-RNAi 植株相較于野生型ZH11側(cè)根變短。利用10 μmol/L 吲哚-3-乙酸IAA處理后，OsOFP6-RNAi 植株側(cè)根長度輕微變短變稀疏；而ZH11 與OsOFP6-OE 的側(cè)根顯著變短，密度嚴(yán)重降低［13，17］。本研究中，ZH11 vs OsOFP6-RNAi 的DEGs的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中存在4個與生長素調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的表達(dá)量均下調(diào)，其中OsARF9（LOC_Os04g36054）是生長素應(yīng)答因子、OsGH3.6（LOC_Os05g05180）是IAA失活相關(guān)基因、LOC_Os05g09480是OsIAA16-生長素反應(yīng)型AUX/IAA基因家族成員、OsAUX3（LOC_Os05g37470）生長素內(nèi)向轉(zhuǎn)運載體，從生長素應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄活性以及內(nèi)向轉(zhuǎn)運載體3個方面，來控制生長素的濃度，影響植株側(cè)根的生長發(fā)育。因此，我們推測OsOFP6基因通過生長素應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄活性以及內(nèi)向轉(zhuǎn)運載體3個方面調(diào)節(jié)生長素濃度進(jìn)而調(diào)控水稻側(cè)根發(fā)育。

3.3 OsOFP6基因通過赤霉素途徑影響水稻植株高度

赤霉素（GA）與水稻株高密切相關(guān)，能夠增加細(xì)胞分裂數(shù)量、促使細(xì)胞伸長。目前，發(fā)現(xiàn)了許多與赤霉素相關(guān)的基因，如OsGA20ox3基因突變體株高增加，GA1和GA4積累增加［28-31］。研究發(fā)現(xiàn)OsOFP6-RNAi 植株明顯矮于野生型ZH11，但可以通過外源施加 GA3使OsOFP6-RNAi 植株完全恢復(fù)［13，20］，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，OsOFP6-RNAi可能通過下調(diào)編碼赤霉素相關(guān)基因OsGA2ox3（LOC_Os01g55240）、OsGA2ox10（LOC_Os05g11810）的表達(dá)水平從而使植株矮化。

3.4 OsOFP6基因正調(diào)控水稻抗旱和抗冷

OFPs作為植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物的生長發(fā)育。前人研究表明，OFPs基因主要影響生長發(fā)育，而在抵御逆境脅迫方面鮮有報道。而我們前期的研究表明，OsOFP6對水稻在抵御干旱脅迫以及冷害方面具有正調(diào)控作用。

本研究通過對ZH11和OsOFP6-OE株系、OsOFP6-RNAi株系的差異表達(dá)基因的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要在細(xì)胞、催化活性和結(jié)合3個過程中富集。從KEGG代謝通路來看過OFP6表達(dá)株系的差異表達(dá)基因主要與氨基酸糖和核苷酸糖代謝緊密相關(guān)，RNAi株系與核糖體關(guān)系密切。結(jié)合OsOFP6不響應(yīng)ABA，但過表達(dá)株系耐旱，而干擾株系的側(cè)根變短，IAA處理后側(cè)根密度增加，OsOFP6-OE株系與OsOFP6-RNAi株系對NPA有不同的反應(yīng)［17］，而水稻在受到干旱脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生H2O2等活性氧，活性氧的大量積累，會危害植物的各種生理功能［32］。我們推測，OsOFP6-OE株系可能感知外界環(huán)境變化后，促使IAA的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)運，但由于一些氨基酸等代謝途徑的影響，導(dǎo)致信號無法傳遞至ABA途徑，而將信號轉(zhuǎn)至另一條非激素途徑，提高了過氧化氫酶的活性，從而增強(qiáng)了水稻的抗逆性。根據(jù)OsOFP6-RNAi株系較野生型ZH11的次生細(xì)胞壁變薄，纖維素和木質(zhì)素含量減少，使水稻葉夾角增大［20］，可以推測，OsOFP6-RNAi會介導(dǎo)葉枕中的多個調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量的基因差異表達(dá)，進(jìn)一步影響下游相關(guān)基因表達(dá)，從而增加水稻的葉夾角。

綜上，本研究利用RNA-Seq技術(shù)分析了OsOFP6基因過表達(dá)、RNA干擾對中花11的影響，通過分析OsOFP6基因的代謝通路與差異基因表達(dá)，推測了OsOFP6基因的作用通路，這將對解析OsOFP6及OFP家族的分子機(jī)制研究具有重要意義，可為后續(xù)水稻株型建成以及抗逆方面的遺傳改良提供更多資源及新思路。

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收稿日期：2022-12-20

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31970523）。

作者簡介：黃梅艷（1998—），女，湖北恩施人，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：2017301016@st.gxu.edu.cn。

通信作者：李建雄，博士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：jxli920@gxu.edu.cn。