鴨胚胎發育后期胸肌萎縮相關通路及基因鑒定

摘要：與哺乳動物不同，禽類胚胎在卵中發育，在胚胎后期表現為胸肌萎縮，為探明其涉及的分子機制，探索高郵鴨和金定鴨在孵化后18胚齡（ed）至出雛后7日齡（d）的胸肌發育規律，在21 ed、27 ed和5 d 3個時間點采集胸肌樣品進行轉錄組測序（RNA-seq）。采用加權基因共表達網絡分析（WGCNA），以及基于KEGG數據庫的過表征（ORA-KEGG）和基因集富集分析（GSEA-KEGG）2種功能富集分析方法，鑒定與27 ed胸肌萎縮特征相關的信號通路及相關基因；最后通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法驗證WGCNA得到的棕色模塊中核心基因的表達水平。高郵鴨和金定鴨的胸肌質量均從18 ed到24 ed迅速增加，24 ed開始到1 d逐漸下降，1 d后繼續增加。通過WGCNA得到的7個共表達模塊中棕色模塊與27 ed的相關性最高（r=0.98，P=2×10-12），該模塊內的基因通過ORA-KEGG方法富集到了氧化磷酸化和檸檬酸循環2條能量代謝相關的信號通路。通過GSE-KEGG方法對所有轉錄表達的基因功能富集，挖掘到了自噬相關的信號通路。qRT-PCR驗證的棕色模塊內基因中，自噬通路中的突觸體相關蛋白29（SNAP29）和蛋白激酶AMP激活的催化亞基α2（PRKAA2）基因在27 ed時表達量顯著增加（Plt;0.05）。在胚胎后期，鴨胸肌出現發育停滯甚至萎縮，這可能是胸肌動員降解以釋放能量從而應對能量緊張狀態的結果。在這一過程中，能量傳感器AMPK的激活和自噬途徑中SNAP29等關鍵基因表達的升高可能是胸肌蛋白質降解途徑激活的原因。

關鍵詞：鴨；胚胎；胸肌；WGCNA；GSEA

中圖分類號：S834.2 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0190-10

禽類出生后肌纖維數量就不再變化［1-3］，后期肌肉的增加僅依靠肌肉的肥大，因此禽類上市日齡時的產肉量主要取決于胚胎發育后期骨骼肌肌纖維的數量。胸肌是禽類肌肉的主要組成部分，挖掘影響肌纖維發育的關鍵基因及胸肌發育的調控機制，對禽類產肉性狀的選種選育具有重要意義。

在動物胚胎發育過程中，肌原細胞增殖分化為多核肌管，最終形成成熟的肌纖維。在哺乳動物中，胸肌的質量在胚胎發育期間持續增長［4］，而禽類胚胎胸肌發育過程較為復雜，在胚胎發育后期出現發育遲緩甚至萎縮現象［5-8］。禽類胚胎的發育獨立于母體子宮［9］，發育后期卵內的能量及營養被極大消耗，推測可能為了應對這種能量緊缺狀態而引起胸肌動員，致使胸肌出現發育阻滯甚至萎縮［10］，但具體的分子機制還不清楚。高郵鴨和金定鴨是國內體型相差較大的2個品種，肌肉生長具有明顯的表型差異，是研究禽類肌肉生長發育分子機制的理想材料。

轉錄意味著基因信息的流動，是基因表達的第1步也是關鍵的調控步驟。個體表型的發育變化必然涉及到眾多基因表達水平的變化。通過轉錄組測序（RNA-seq）技術，可以同時檢測生物體中數萬個基因的表達水平，從而在整體水平上揭示特定的生物過程。為此，利用RNA測序方法檢測高郵鴨、金定鴨胚胎發育中后期及出雛早期胸肌組織的基因表達水平，同時利用不同的生物信息學方法鑒定相關的信號通路及重要基因，旨在為禽類胚胎發育后期胸肌發育阻滯現象提供科學合理的解釋。

1 材料與方法

1.1 試驗群體與組織樣采集

2022年收集由家養動物種質資源共享服務平臺提供的高郵鴨和金定鴨種蛋各200枚，于江蘇省家禽科學研究所微電腦全自動孵化機（山東德州，河北科裕農業機械有限公司）中孵化。在18、21、24、25、27 ed （胚齡，即孵化后出雛前的日齡）時每個品種各隨機選擇15枚種蛋，開殼后擦盡胚胎表面液體，稱胚胎質量；解剖后查看性腺，選擇5只母胚分離左右兩側胸肌，左側胸肌稱質量，右側胸肌冷凍保存。在出雛后3、5、7 d每個品種各隨機選擇5只母鴨稱量體質量。解剖后分離左右兩側胸肌，左側胸肌稱質量，分析胸肌質量以及體質量的變化規律；右側胸肌在靠近胸骨處切取30 mg后冷凍保存，用于后續的RNA-seq分析。

1.2 胸肌組織RNA-seq與質控

根據胸肌發育規律，選擇胸肌快速發育期（21 ed）、萎縮期（27 ed）、恢復增長期（5 d）高郵鴨、金定鴨的右側胸肌冷凍樣品，使用Trizol試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA，使用Illumina Tru Seq RNA樣品制備試劑盒（Illumina，美國）構建cDNA文庫。cDNA文庫質控合格后交由北京諾禾致源科技股份有限公司使用HISeqTM 2000測序儀（Illumina，美國）進行RNA測序。為保證信息分析的質量，不同品種不同時間點分別選擇3個測序質量較高的樣品（共18個樣品），對原始reads進行過濾和去雜，同時去除接頭、重復冗余序列和低質量序列后獲取clean reads。最后使用TopHat（v2.0.12）軟件［11］將clean reads與鴨參考基因組（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release-80/fasta/anas_platyrhynchos/dna/）比對，使用HTSeq（v0.6.1）軟件［12］獲取raw counts以及每個基因的RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）［13］。

1.3 WGCNA方法挖掘基因共表達模塊

在所有18個不同樣本中，根據每個基因在不同樣本中的RPKM計算絕對偏差（MAD），選擇絕對偏差大于4.9的5 000個基因進行權重基因共表達網絡分析（WGCNA）。基于RPKM計算每對基因的皮爾遜相關系數，使用R語言WGCNA包（v1.72）［14］計算最佳軟閾值，并構建拓撲重疊矩陣（TOM）［15］。采用分層聚類方法構建基因共表達模塊，相似模塊合并閾值設置為0.25，每個模塊內的最小基因數設置為30。將不同時間點設置為啞變量，對各個模塊的特征基因表達水平與不同時間點進行相關性分析，識別發育階段特異性共表達模塊［16］。

1.4 基因功能富集分析

雞作為家禽中的模式動物，KEGG數據庫信息更加豐富。使用雞KEGG通路數據進行功能富集分析，可以獲得更可靠和豐富的結果。利用Bioconductor網站（https：//www.bioconductor.org/）中的雞org.Gg.eg.db數據包，將鴨的基因名稱轉換成雞基因ID（基因的唯一編碼）。基于KEGG數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/），利用R語言clusterProfiler包（v4.4.4）［17］對WGCNA得到的共表達模塊（其基因名稱已轉換為雞基因ID）進行過表征富集分析（ORA-KEGG）。同時分別將高郵鴨、金定鴨所有基因（其基因名稱已轉換為雞基因ID）在21 ed到27 ed的變化倍數以及27 ed到5 d的變化倍數從大到小降序排列，利用clustProfiler包進行基因集富集分析（GSEA-KEGG）。2種功能富集分析方法共同挖掘胚胎發育特征相關的信號通路及候選基因。

1.5 棕色模塊核心基因篩選

統計WGCNA得到的棕色模塊內基因的成員隸屬度值（MM）、基因重要性（GS）2個指標間的相關性并繪制散點圖。提取棕色模塊內與功能富集分析得到的重要通路——氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、檸檬酸循環（citrate cycle）、自噬、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）以及過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路相關的基因，基于模塊內連通度繪制豎線圖。5個通路中的基因分別按照其在棕色模塊內的連通度大小降序排列，分別選擇連通度排名前3（如果該通路中的基因數量小于3，則選擇全部基因）的基因作為棕色模塊的核心基因。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證

通過NCBI網站的Primer-BLAST工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計12個核心基因以及內參基因（BACTIN）的qRT-PCR引物（表1）。使用天根熒光定量SYBR Green試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］對高郵鴨、金定鴨RNA-seq的剩余樣品進行qRT-PCR，檢測不同基因的mRNA表達水平。

分別針對qRT-PCR和RNA-seq這2種方法，計算每個基因27 ed、5 d的表達水平相對于21 ed表達水平的比值，利用R語言rstatix包（v0.7.2）中的anova_test（）函數進行方差分析，統計21 ed、27 ed 和5 d各基因表達水平的顯著性差異，比較 qRT-PCR 與RNA-seq 2種方法檢測的基因表達水平變化趨勢差異情況，驗證RNA-seq數據的可靠性。

2 結果與分析

2.1 鴨體質量和胸肌質量的變化趨勢

分別稱量高郵鴨、金定鴨18、21、24、25、27 ed以及3、5、7 d時的胸肌質量和體質量，比較不同時間點胸肌質量和體質量的變化趨勢。高郵鴨和金定鴨的體質量變化趨勢相似，從18 ed到7 d體質量均逐漸增大（圖1-A），而胸肌質量的變化趨勢均分為3個階段：18 ed到24 ed為快速增長階段，24 ed 到1 d為萎縮階段以及1 d之后為恢復增長階段（圖1-B）。

2.2 RNA-seq數據質量評估

根據胚胎發育期胸肌發育的階段性特征，選擇快速增長階段、萎縮階段以及恢復增長階段3個時期的中間時間點，即21、27 ed和5 d的胸肌組織進行RNA-seq后，分別選擇3個測序質量較高的樣品進行后續分析。每個樣品測序數據的Q20均接近95%，Q30在90%左右（表2）。

2.3 WGCNA方法挖掘基因共表達模塊

利用RPKM計算每個基因的中位數絕對偏差（MAD），選擇MAD大于4.9的5 000個基因用于WGCNA。通過不同的軟閾值β計算各自的無尺度網絡及平均連通度，當β=14時無尺度網絡的擬合度超過0.85（圖2-A），且平均連通度小于120（圖2-B），達到WGCNA的分析要求。

使用一步法構建拓撲重疊矩陣（TOM），根據矩陣內部元素的相異性將所有基因劃分成不同的模塊，不同模塊按照顏色命名。5 000個基因中有230個基因沒有歸并到任何模塊（使用灰色顏色顯示），其他基因模塊劃分到7個模塊中（圖3）。其中藍綠色模塊包含的基因數量最多，達到2 639個；黑色模塊包含的基因數量最少，只有51個（表3）。

各模塊特征基因與不同時間點發育特征的相關性熱圖顯示，黑色、綠色、棕色、紅色、黃色模塊與胸肌處于萎縮階段的27 ed時間點相關性較強（圖4和圖5-A）。將這些模塊特征基因的表達量與各自模塊內所有基因的表達量進行相關性（用MA表示）分析發現，對于高郵鴨，黑色模塊MA為0.46（圖 5-B），綠色模塊為0.43（圖5-D），顯著高于金定鴨的0.09（P=0.003 9）和0.11（P=0.017 1）；而金定鴨紅色模塊MA為0.41（圖5-E），顯著高于高郵鴨的0.05（P=0.046 5），表明這些模塊具有品種特異性。高郵鴨和金定鴨棕色模塊MA分別為0.31和0.34（P=0.373 2）（圖5-C），高郵和金定鴨黃色模塊MA分別為-0.28和-0.29（P=0.654 2）（圖5-F），品種之間差異均不顯著，即這2個模塊沒有品種特異性。

2.4 基因功能富集分析

使用clusterProfile包對與27 ed相關的黑色、棕色、綠色、紅色和黃色模塊進行ORA-KEGG功能富集分析。黑色和紅色模塊中的基因均未顯著富集到[CM（21]KEGG的任何通路，而棕色、綠色和黃色模塊中的基因分別富集到5、2、3條KEGG通路中（圖6）。這些通路主要與能量、蛋白代謝相關，包括氧化磷酸化、檸檬酸循環等能量代謝相關通路，以及內質網蛋白質加工、精氨酸和脯氨酸代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等蛋白質和氨基酸代謝相關通路。

基于不同時間點的基因表達變化進行GSEA-KEGG功能富集分析，高郵鴨27 ed與21 ed、金定鴨27 ed與21 ed的表達水平秩序改變的基因均富集在4條重要的KEGG通路上，包括自噬、mTOR信號通路、氧化磷酸化以及PPAR信號通路（圖7-A和圖7-C）。與27 ed相比，高郵鴨5 d時的表達水平秩序改變的基因主要富集于氧化磷酸化和內質網蛋白質加工2條通路（圖7-B），而金定鴨僅富集到MAPK信號通路（圖7-D）。

2.5 棕色模塊核心基因篩選

WGCNA得到的7個模塊中，棕色模塊MA沒有品種特異性，且與27 ed胸肌萎縮的發育特征強正相關。棕色模塊內基因的成員隸屬度（MM）與基因重要性（GS）相關性達到0.95（P=0.024 2），其中與氧化磷酸化（gga00190）、檸檬酸循環（gga00020）、自噬（gga04140）、mTOR信號通路（gga04150）以及PPAR信號通路（gga03320）相關基因中，除了PPA2信號通路相關基因，其他基因都具有高MM和GS（圖8-A）。依據模塊內基因的連通度降序排列，分別選擇5個通路中連通度排名前三（如果該通路中的基因數量小于3個，則選擇全部基因）的12個基因（表1），且連通度均大于15（圖8-B），屬于棕色模塊的核心基因。

2.6 重要基因的qRT-PCR驗證

以BACTIN為內參基因，使用qRT-PCR方法檢測棕色模塊內12個核心基因的表達水平，并與RNA-seq結果相比較，驗證RNA-seq結果的可靠性。從21 ed到5 d期間所選擇的核心基因表達水平變化趨勢及不同時間點之間的顯著性差異在 qRT-PCR 與RNA-seq這2種方法間相似（圖9），說明RNA-seq分析結果可靠。其中，27 ed時SNAP29基因的表達水平顯著高于21 ed和5 d時，PRKAA2基因27 ed和5 d時的表達水平顯著高于21 ed時。

3 討論

禽類胚胎在獨立的卵中發育，卵內的營養物質有限，因此與哺乳動物相比，胚胎發育模式極為特殊。本研究系統比較了高郵鴨和金定鴨21 ed到 7 d 時間段內胸肌的發育模式，發現2個品種的胸肌在18 ed到24 ed處于快速發展階段，24 ed到1 d胸肌發育停滯甚至萎縮，1 d后開始恢復生長。Chen等發現，鴨胸肌質量在22、25、27 ed逐漸下降，得出鴨胸肌從22 ed開始萎縮［5］。在本研究中，將胸肌稱質量的胚胎時間點設置為21、24、27 ed，進一步將胸肌萎縮發生的開始時間點推遲到24 ed。由于[CM（21]表型的變化相對于基因的轉錄表達有一定的滯后性，因此選取胸肌持續生長的18 ed和24 ed之間的時間點21 ed，持續萎縮的24 ed和1 d之間的時間點27 ed，以及恢復增長的1 d到7 d之間的時間點5 d這3個時間點進行比較研究。

生物體內基因表達的調控是一個級聯反應網絡，核心基因表達水平的小幅度變化即可能導致下游基因表達或表型的顯著變化。RNA-seq等常規方法首先需要篩選顯著差異表達的基因進行后續分析，這可能會排除基因表達變化沒有達到顯著閾值但在基因調控網絡中發揮核心關鍵作用的基因。WGCNA方法根據多個樣本的基因表達水平直接計算各基因之間的皮爾遜相關系數，通過合適的軟閾值冪次運算后構建無尺度網絡［14］，將所有基因劃分為基因數量較少的多個共表達模塊。將每個模塊作為一個整體進行分析，可以更準確、系統地篩選與特定表型相關的功能基因。該方法目前已廣泛應用于動物［16，18］、植物［19-20］和醫學［21-22］。

雞作為家禽中的模式動物，基因功能的挖掘及注釋更加系統深入，KEGG通路的信息也更為全面。本研究使用雞KEGG通路數據進行功能富集分析，以獲得更可靠和豐富的結果。選擇與鴨27 ed相關性最高的棕色模塊，對該模塊內的基因進行功能富集分析，篩選到了氧化磷酸化和檸檬酸循環2條信號通路。這2條通路均與能量代謝有關［23-24］，說明鴨胸肌中與能量代謝相關的活動在胚胎發育期更為強烈。由于卵中的營養物質有限，而胚胎發育后期機體活動頻繁、代謝頻率加快，可能導致營養和能量不足。

肌肉發育是一個消耗能量的過程，有研究認為，禽類胚胎發育后期胸肌發育停滯甚至萎縮，這可能是動員胸肌降解以釋放能量從而應對能量緊張狀態的結果［25-26］。在本研究中，使用基因集富集分析獲得了與肌肉萎縮相關的自噬信號通路。自噬是一種不同于凋亡的程序性細胞死亡，其中涉及到的自噬-溶酶體系統是真核細胞中的一種蛋白質降解系統［27］。自噬通路的激活預示著肌肉萎縮［28］的發生，其中SNAP29基因是該通路中的關鍵基因［29-30］。在果蠅中，SNAP29的缺失完全抑制了饑餓誘導的自噬體［31］的形成，而激活的SNAP29被證明能夠增加自噬活性，促進蛋白質的自噬降解過程［32］。本研究發現，高郵鴨和金定鴨在21～27 ed時SNAP29基因表達量顯著升高，27 ed～5 d時呈顯著降低趨勢，推測27 ed時可能發生了自噬-溶酶體介導的蛋白質降解從而引起胸肌萎縮。自噬途徑中的另一個重要基因PRKAA是AMPK復合體的一個主要亞基AMPKα2的編碼基因［33］。AMPK復合體作為ATP穩態水平的保持者，是細胞能量傳感器［34-35］，其在萎縮過程中具有調節肌肉退化的作用［36-37］。當機體能量緊張時，AMPK激活后抑制消耗ATP的合成代謝途徑，并激活產生ATP的分解代謝途徑，最終穩定能量平衡［38］。同時，ULK1多個位點被AMPK直接磷酸化［39］，激活其下游靶點，如ATG9［40］和BECN1［41］，促進自噬。本研究發現27 ed時鴨胸肌中PRKAA2基因水平顯著升高，這可能與此時卵中營養物質的顯著減少導致能量失衡有關。AMPK的激活與SNAP29、ULK1等自噬通路相關基因一起啟動蛋白質降解通路，最終導致胸肌發育停滯甚至萎縮。

4 結論

綜上，本研究利用RNA-seq分析鑒定到了與鴨胚胎發育后期胸肌發育停滯甚至萎縮有關的氧化磷酸化、檸檬酸循環和自噬等幾個重要的信號通路。能量傳感器AMPK的激活和自噬途徑中SNAP29等關鍵基因表達的升高可能是胸肌蛋白質降解途徑激活的原因。這些發現有助于加深鴨胚胎胸肌發育復雜分子機制的理解。

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收稿日期：2023-05-08

基金項目：江蘇省種業振興“揭榜掛帥”項目（編號：JBGS［2021］111、JBGS［2021］030）；蘇州市科技計劃（編號：SNG2020068）；江蘇省現代農業（水禽）產業技術體系項目（編號：JATS［2022］404）。

作者簡介：劉宏祥（1985—），男，江蘇儀征人，碩士，副研究員，主要從事家禽遺傳資源保護與利用研究。E-mail：lhxatyz@foxmail.com。

通信作者：李慧芳，博士，研究員，主要從事家禽遺傳資源保護與利用研究。E-mail：lhfxf_002@aliyun.com。