玉屏風加味鼻噴劑對變應性鼻炎大鼠IgE、sIgA及鼻黏膜病理的影響*

習媛,劉玉崟,廖超,張娜,賀心寧,田理

成都中醫藥大學附屬醫院,四川 成都 610075

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是特應性個體暴露于過敏原后由免疫球蛋白 E(immunogloblin E,IgE)介導的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病,主要癥狀為打噴嚏、鼻塞和鼻癢、流清涕等。在過去幾十年中,AR的發病率顯著升高[1],全世界有10%～20%人口深受其困擾[2],目前,AR采用糖皮質激素、過敏反應介質阻斷劑、免疫調節劑等藥物治療為主,但患者會出現一些不良反應[2-3]。近年來,中醫藥防治 AR已逐漸被認可,其可通過多靶點、多機制發揮作用,具有控制癥狀、預防復發、身心調護等優勢[4-5]。四川省名中醫田理主任醫師在20余年AR診療中凝練出AR的核心病因病機是肺衛虧虛、虛邪賊風外襲、正邪搏結、血瘀鼻竅、腠理不固,研發出玉屏風加味鼻噴劑,具有益氣固表、活血通竅等作用,并在前期研究中篩選出最佳藥效濃度(1.05 g·mL-1)[6],現階段基于臨證經驗運用玉屏風加味鼻噴劑每日2次治療AR,臨床反饋療效確切[7-9],但尚缺少頻次及給藥時間相關的實驗研究。本研究建立了變應性鼻炎大鼠模型,考察不同用藥頻率下玉屏風加味鼻噴劑對AR大鼠的影響,以期為確定臨床最優用藥方案提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物SPF級6～7周齡SD雄性大鼠60只,體質量160～190 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號SCXK(京)019-0008,飼養于光線良好,通風,溫度、濕度適宜的實驗室,大鼠自由飲水,普通飼料喂養。本實驗經成都中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審核通過,倫理審查編號:2022DL-010。

1.2 藥物與試劑糠酸莫米松鼻噴劑(美國默沙東公司,貨號:U025821);卵清蛋白、氫氧化鋁粉末[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司,貨號:M0228A、MKCM1237];大鼠分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulins A,sIgA)、IgE ELISA 檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號:E-EL-R0875C、E-EL-R0517C);蘇木素染液(上海懿洋儀器有限公司,批號:201901,harris方法配置);伊紅染液(成都科隆化學品有限公司,批號:2021012501,配置成0.25%水溶液)。

1.3 儀器Minista型低溫離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司);DNM9602G型酶標儀(成都普朗醫療設備有限公司);TSJ-Q型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-III型包埋機(常州中威電子儀器廠);RM2235型輪轉式切片機(德國LEICA公司);CX31型光學顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

2 方法

2.1 藥物制備玉屏風加味鼻噴劑由成都中醫藥大學藥劑科根據已有玉屏風加味鼻噴劑制劑工藝[10]制備,方劑組成為蜜炙黃芪30 g,生白術15 g,防風10 g,酒川芎10 g,牡丹皮10 g,煎煮濃縮配至濃度 1.05 g·mL-1,每支10 mL。

2.2 大鼠模型制備及分組給藥大鼠適應性喂養3 d后,參考文獻所述[11]制備變應性大鼠模型,具體如下:將0.3 mg OVA和30 mg Al(OH)3溶于1 mL生理鹽水中形成混懸液給予大鼠腹腔注射致敏,隔日1次,共7次。第15天開始,每只大鼠以50 μL 2% OVA溶液滴鼻局部激發,每日1次,共7次。造模結束30 min后參照參考文獻[12]對大鼠進行行為學評分,具體標準見表1,疊加評分≥5分造模成功。大鼠造模成功后按照隨機數字法分為模型組、玉屏風加味鼻噴劑低頻次組、玉屏風加味鼻噴劑中頻次組、玉屏風加味鼻噴劑高頻次組及糠酸莫米松組,每組10只。另設正常組10只。玉屏風加味鼻噴劑低、中、高頻次組大鼠每日分別給予該藥物1次、2次、3次滴鼻,每側50 μL,每次用藥間隔不少于4 h。糠酸莫米松組給予糠酸莫米松鼻噴劑滴鼻,每側 50 μL,每日1次。正常組及模型組以生理鹽水滴鼻,每側50 μL,每日1次,連續干預4周。

2.3 大鼠行為學評分造模結束后及治療1周、2周、4周時,在滴鼻給藥結束30 min后,參照表1,觀察各組大鼠5 min內的行為對大鼠進行行為學評分,從大鼠打噴嚏、抓鼻及清涕3個方面進行評價,疊加法記錄總分值,用于判定造模情況和治療情況。

表1 大鼠行為學量化評分標準

2.4 大鼠血清IgE水平檢測各組大鼠分別在給藥1周、2周、4周后給予體積分數2%戊巴比妥鈉麻醉,取1.5 mL左右眼眶靜脈血,離心后取血清,參照大鼠ELISA 試劑盒說明書檢測血清中IgE的水平。

2.5 大鼠鼻咽沖洗液中sIgA水平檢測末次治療結束后禁食不禁水12 h,大鼠麻醉后取仰臥位于手術板上,用移液器吸取500 μL生理鹽水沖洗鼻腔,沖洗3次,收集鼻、咽流出的沖洗液,不少于1 mL,即為鼻咽沖洗液,離心后取上清,按照大鼠slgA ELISA 試劑盒說明書步驟檢測sIgA水平。

2.6 大鼠鼻黏膜病理變化分別于大鼠給藥2周、4周時,從各組大鼠中隨機抽取3只進行麻醉,處死后取鼻黏膜,置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定 48 h,脫水,包埋,切片(厚度3 μm),進行HE 染色,光鏡下觀察鼻黏膜病理改變,任選10個200倍視野觀察黏膜上皮層、固有層、基底膜和黏膜下層的病理狀況,并根據文獻標準[13]計分量化,見表2。

表2 大鼠鼻黏膜病理量化評分標準

3 結果

3.1 玉屏風加味鼻噴劑對大鼠行為學的影響與正常組比較,模型組行為學評分升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,給藥1周時,玉屏風加味鼻噴劑中、高頻次組行為學評分降低;給藥2周、4周時,玉屏風加味鼻噴劑各頻次組及糠酸莫米松組大鼠行為學評分降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與玉屏風加味鼻噴劑低頻次組比較,給藥1周時玉屏風加味鼻噴劑中、高頻次組大鼠行為學評分降低;給藥2周、4周時玉屏風加味鼻噴劑中頻次組及糠酸莫米松組大鼠行為學評分降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與給藥1周時比較,給藥2周、4周時玉屏風加味鼻噴劑中頻次組及糠酸莫米松組大鼠行為學評分降低;與給藥2周時比較,給藥4周時玉屏風加味鼻噴劑中頻次組及糠酸莫米松組大鼠行為學評分降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠行為學評分比較 分)

3.2 玉屏風加味鼻噴劑對大鼠血清IgE的影響與正常組比較,模型組大鼠血清IgE水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,給藥1周、2周時,玉屏風加味鼻噴劑各組及糠酸莫米松組大鼠血清IgE水平下降;給藥4周時,玉屏風加味鼻噴劑中、低頻次組及糠酸莫米松組大鼠血清IgE水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與玉屏風加味鼻噴劑低頻次組比較,在給藥2周、4周時玉屏風加味鼻噴劑中頻次組及糠酸莫米松組大鼠血清IgE水平下降,差異有統計學意義(P<0.05)。與給藥1周時比較,給藥4周時玉屏風加味鼻噴劑中頻次組及糠酸莫米松組大鼠血清IgE水平下降;與給藥2周比較,給藥4周時玉屏風加味中頻次組大鼠血清IgE水平下降,差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 大鼠血清IgE水平的比較

3.3 玉屏風加味鼻噴劑對大鼠鼻黏膜組織形態學的影響正常組大鼠鼻黏膜表面被覆移行上皮、假復層柱狀上皮,細胞排列均勻、形態正常。模型組大鼠鼻黏膜組織結構紊亂,間質水腫,上皮大面積脫落化生,大量炎性細胞浸潤,血管擴張明顯。給藥2周時,與模型組比較,玉屏風加味鼻噴劑中、高頻次組及糠酸莫米松組大鼠鼻黏膜炎性浸潤減輕,上皮層可見明顯的再生微絨毛,玉屏風加味鼻噴劑低頻次組大鼠鼻黏膜病理改變未見明顯改善。給藥4周時,玉屏風加味鼻噴劑低頻次組較2周前大鼠鼻黏膜炎性浸潤有所減輕、上皮層結構恢復;玉屏風加味鼻噴劑中頻次組可見大鼠鼻黏膜結構與正常組無明顯差異,間質無水腫,黏膜上皮完整性進一步修復,纖毛上皮未見明顯脫落,纖毛排列整齊,方向一致;玉屏風加味鼻噴劑高頻次組及糠酸莫米松組鼻黏膜可見假復層柱狀上皮,纖毛形態基本正常且部分脫落,腺體增生。

評分數據分析顯示,與正常組比較,模型組大鼠鼻黏膜病理計分升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,給藥2周及4周時,玉屏風加味鼻噴劑各組及糠酸莫米松組大鼠鼻黏膜病理計分降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與玉屏風加味鼻噴劑低頻次比較,給藥2周時玉屏風加味鼻噴劑中、高頻次組及糠酸莫米松組大鼠鼻黏膜病理計分下降;而在給藥4周時,玉屏風加味鼻噴劑中頻次組大鼠鼻黏膜病理計分下降,玉屏風加味鼻噴劑高頻次組大鼠鼻黏膜病理評分上升,差異有統計學意義(P<0.05)。與給藥2周時比較,在給藥4周時玉屏風加味鼻噴劑中頻次組大鼠鼻黏膜病理評分下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2及表5。

注:A:正常組;B:模型組;C:玉屏風加味鼻噴劑低頻次組;D:玉屏風加味鼻噴劑中頻次組;E:玉屏風加味鼻噴劑高頻次組;F:糠酸莫米松組圖1 給藥2周后各組鼻黏膜HE染色情況(×400)

注:A:正常組;B:模型組;C:玉屏風加味鼻噴劑低頻次組;D:玉屏風加味鼻噴劑中頻次組;E:玉屏風加味鼻噴劑高頻次組;F:糠酸莫米松組圖2 給藥4周后各組鼻黏膜HE染色情況(×200)

表5 各組大鼠鼻黏膜病理計分比較 分)

3.4 玉屏風加味鼻噴劑對大鼠鼻咽沖洗液sIgA的影響與正常組比較,模型組鼻咽沖洗液slgA水平下降;與模型組比較,玉屏風加味鼻噴劑各組及糠酸莫米松鼻咽沖洗液slgA水平升高;與玉屏風加味鼻噴劑低頻次組比較,玉屏風加味鼻噴劑中、高頻次組鼻咽沖洗液slgA水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 大鼠鼻咽沖洗液sIgA水平的比較

4 討論

AR 在中醫學中稱作“鼻鼽”,因肺氣虛,衛氣不足,鼻部腠理疏松,外邪或癘氣乘虛而入,正邪相爭而發病。玉屏風加味是以具有“強健肺衛、益氣固表”功能的玉屏風散化裁而成。玉屏風散已廣泛用于 AR 臨床治療,療效顯著,還具有不良反應少和復發率低、增強免疫的優勢[14-15]。方中黃芪補氣升陽以固表,白術健脾胃、溫分肉,防風驅風解表,川芎行氣祛風又可活血,丹皮破積血而生新血。鼻為多氣多血之官,既是肺系之氣升降出入之門戶,又為營血循行之樞紐,將此五味藥合用,煎煮濃縮后直接噴于鼻黏膜表面更快的發揮強健腠理、祛邪益氣、活血通竅之效。

在AR發病中,鼻黏膜是接觸變應原的首要部位,更是抵御變應原的第一道屏障。大量研究發現,塵螨、花粉、PM2.5等變應原及環境污染物會降解緊密連接蛋白或誘導鼻黏膜上皮細胞損傷[16-18],隨后激活細胞信號傳導、轉錄和誘導炎癥介質釋放[19-20],形成一個病理損傷-炎癥反應-損傷加重的惡性循環,從而誘發及加重AR病情。同時,鼻黏膜還協同黏膜固有免疫細胞通過分泌黏液和免疫因子發揮黏膜免疫的作用[16]。AR作為一種免疫性疾病,黏膜免疫在AR中的作用在近年來日益受到重視。黏膜組織中最主要的免疫球蛋白sIgA是黏膜免疫系統的主要效應分子,存在于機體的多種分泌物中[21]。當機體呼吸道發生免疫應答時,上下呼吸道黏膜可同時產生大量sIgA以抵御病原體及有害物質入侵,維持黏膜穩態[22-23]。sIgA缺乏會使呼吸道黏膜免疫反應中存在免疫缺陷,導致sIgA低下人群更易發生慢性或反復感染、自身免疫疾病等[24]。因此,鼻黏膜損傷及黏膜免疫低下可能是AR 反復發作的重要原因。

此次實驗中,模型組大鼠行為學積分>5分,鼻黏膜炎性浸潤明顯、結構紊亂、間質水腫、纖毛脫落,可判斷AR大鼠模型建立成功。在分別給予AR大鼠每日1次、每日2次、每日3次玉屏風加味鼻噴劑滴鼻后,玉屏風加味鼻噴劑中頻次組大鼠鼻部癥狀明顯緩解,說明玉屏風加味鼻噴劑可有效改善AR大鼠鼻部癥狀。與模型組比較,玉屏風加味鼻噴劑中頻次組在給藥2周后大鼠鼻黏膜炎癥浸潤改善,尤其是鼻上皮纖毛系統得以修復,4周后鼻上皮完整性明顯好轉,纖毛排列整齊,方向一致,鼻黏膜結構與正常組比較無明顯差異,提示玉屏風加味鼻噴劑具有修復鼻黏膜損傷,恢復鼻上皮纖毛系統功能的作用。同時玉屏風加味鼻噴劑可以明顯提高AR大鼠鼻咽部沖洗液sIgA的含量,可見玉屏風加味還具有提高黏膜免疫的作用。

此外,AR作為最常見的非感染性鼻炎,其是由IgE介導的變態反應性疾病[25-26]。當鼻黏膜接觸過敏原時,首先誘導局部產生特異性IgE,與鼻黏膜的肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面高親和力IgE受體結合,IgE生物活性大大增強從而致敏。再次接觸過敏原時,肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE與過敏原結合活化后釋放組胺、白三烯等炎癥介質,刺激鼻黏膜上的感覺神經末梢和血管,導致鼻癢、打噴嚏、流涕等癥狀[2]。研究發現,AR患者臨床癥狀輕重程度與血清IgE含量密切相關[27],臨床中檢測AR患者血清IgE 的水平對明確 IgE 在AR病程中具體作用也具有重要意義[28],抗IgE也可有效改善癥狀并減少季節性和常年性過敏性鼻炎患者額外給藥的必要性[29]。本實驗中AR大鼠在玉屏風加味鼻噴劑干預后均有不同程度的血清IgE下降,其中中頻次組更為顯著,這提示玉屏風加味鼻噴劑通過降低IgE的水平阻止炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放,從而減輕AR大鼠的癥狀,驗證了玉屏風加味鼻噴劑的臨床療效,但其具體機制需進一步探討。后期擬從明確主要有效成分、挖掘其修復鼻黏膜損傷及強化呼吸道黏膜免疫功能的分子作用機制等方面深入研究。

比較不同時間點下的低、中、高頻次實驗結果后發現,中頻次組更為顯著降低大鼠血清IgE水平、改善大鼠鼻黏膜損傷,并且也可顯著提高大鼠鼻黏膜 sIgA的含量,因此可初步確定“每日2次”為玉屏風加味鼻噴劑最佳使用頻次,推測其原因為“每日2次”滴鼻可使藥物維持在一定的血藥濃度范圍,具體機制尚待進一步深入研究。本研究為玉屏風加味鼻噴劑治療變應性鼻炎及確定臨床最優給藥方案提供了科學依據。

綜上,玉屏風加味鼻噴劑通過修復鼻黏膜損傷、提高黏膜免疫、抑制AR免疫反應等改善AR,有望成一種重要的AR治療外用藥物。