基于Nrf2/HO-1信號通路研究白藜蘆醇在小鼠卵巢冷凍復蘇中的保護作用及機制

張珦， 李惠， 章宜芬， 鄭燕影， 孫怡， 陳劼， 儲樂樂， 應葳， 李長印， 鄭艷莉

（南京中醫藥大學附屬醫院病理科，江蘇南京 210000）

腫瘤放化療作為癌癥的主要治療手段，對女性卵巢功能的損害主要是會引起卵泡凋亡和卵巢間質損傷[1]。育齡女性腫瘤患者放化療后的生育能力保存一直是生殖領域被關注的熱點之一。卵巢皮質冷凍復蘇經原位移植后，卵泡可以自然發育并排卵。因此，卵巢皮質冷凍在生育力保存中的重要性正在受到越來越多生殖專家的關注。然而卵巢皮質冷凍技術還需要進一步改進和優化，如何在卵巢組織冷凍復蘇和移植過程中減少原始卵泡的損失，提高移植后卵泡的存活率，對女性生育力保存技術的發展具有重要意義[2]。

白藜蘆醇是一種植物抗毒素，屬于多酚類化合物，存在于葡萄、虎杖、花生等植物中，研究表明，白藜蘆醇具有抗炎、抗腫瘤、抗細菌、抗病毒、抗氧化等藥理活性[3]。白藜蘆醇作為一種作用較強的天然抗氧化劑，在多種組織和器官中發揮著抗凋亡作用，既往研究發現白藜蘆醇通過影響核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（hemeoxygenase 1，HO-1）信號通路，增強Nrf2 蛋白的表達，減輕細胞氧化應激損傷[4]，但這種保護作用在卵巢冷凍復蘇中是否存在，還需要進一步證實。

本研究采用新生小鼠卵巢冷凍復蘇移植為模型，在冷凍復蘇液中加入白藜蘆醇，通過檢測復蘇后卵巢組織凋亡，觀察移植后小鼠各級卵泡數量及卵巢組織形態變化及卵巢組織中剪切型多聚ADP 核糖多聚糖（Cleaved-PARP）、Nrf2/HO-1信號通路關鍵蛋白的表達變化，探討白藜蘆醇減少卵巢冷凍復蘇損傷的作用機制，以期為白藜蘆醇在卵巢冷凍復蘇中的應用提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取31 只SPF 級5 日齡雌性CD-1小鼠，10 只SPF 級6 周齡雌性CD-1 小鼠，體質量20 ～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養于南京醫科大學醫藥實驗動物中心，晝夜節律12 h/12 h，環境溫度（25±2）℃，相對濕度（50±5）%。動物實驗研究內容經南京醫科大學實驗動物倫理委員會審核通過，倫理編號：1811040。

1.2 主要試劑與儀器L15 培養基（Gibco 公司）；MEM-α（美國Gibco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，廣州潔特生物過濾股份有限公司）；卵巢冷凍液、卵巢復蘇液（日本KITAZATO BioPharma 公司）；Nrf2抗體（美國Proteintech 公司）；HO-1抗體（美國Abcam 公 司）；Cleaved-Caspase-3 抗 體、PARP抗體、Cleaved-PARP 抗體（美國CST 公司）；β-tubulin（南京翼飛雪生物科技有限公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記（TUNEL）異硫氰酸熒光素（FITC）標記的凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；山羊血清、免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、山羊抗小鼠IgG（H+L）-辣根過氧化物酶（HRP）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）-HRP 二抗（南京翼飛雪生物科技有限公司）。倒置顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：TS100）；體式顯微鏡（日本Nikon公司，型號：SMZ1000）；數碼化學發光成像系統（上海Tanon公司，型號：4500SF）；37 ℃細胞培養箱（美國Thermo 公司，型號：150i）；低溫離心機（德國Eppendorf公司，型號：5702R）。

1.3 新生小鼠卵巢分離、冷凍、復蘇選取5 日齡CD-1雌性小鼠13只，處死后酒精消毒，背部取出雙側卵巢（共26 只卵巢）用于冷凍復蘇后進行TUNEL 和Cleaved-Caspase-3 免疫組織化學染色。將卵巢分為空白對照組，模型對照組，白藜蘆醇0.5、2.5、5 μmol·L-1組共5組，每組5只。白藜蘆醇3 個劑量組卵巢在冷凍前用含有0.5、2.5、5 μmol·L-1白藜蘆醇的MEM-α 體外培養1 h，隨后置于含有相同劑量的白藜蘆醇的冷凍液中液氮冷凍，模型對照組卵巢置于空白冷凍液中進行液氮冷凍，4 組均液氮中保存。5 d 后取出組織，模型對照組置于空白復蘇液中進行復蘇，白藜蘆醇3個劑量組分別置于含有0.5、2.5、5 μmol·L-1白藜蘆醇的復蘇液中復蘇。空白對照組不做冷凍復蘇處理。根據TUNEL染色結果選擇白藜蘆醇劑量5 μmol·L-1，并取空白對照組、模型對照組及白藜蘆醇5 μmol·L-1組卵巢組織切片進行Cleaved-Caspase-3 免疫組織化學染色及后續實驗。

另取8只5日齡CD-1雌性小鼠，背部取出雙側卵巢（共16 只卵巢）用于Western Blot蛋白檢測，分為空白對照組、模型對照組及白藜蘆醇5 μmol·L-1組，每組5只卵巢，空白對照組不進行冷凍復蘇直接提取蛋白，模型對照組及白藜蘆醇組同上處理。

剩余10 只5 日齡CD-1 雌性小鼠卵巢用于冷凍復蘇后腎被膜移植實驗。將來源于同只小鼠的雙側卵巢，一側卵巢置于空白培養基中，為模型對照組，另一側卵巢置于含有5 μmol·L-1白藜蘆醇的培養基中設為白藜蘆醇組，培養1 h 后取出卵巢組織。模型對照組卵巢放置于空白冷凍液中冷凍，白藜蘆醇組卵巢放置于含有5 μmol·L-1白藜蘆醇的冷凍液中冷凍后，2 組均置于液氮中保存。5 d后取出組織，模型對照組卵巢置于空白復蘇液中進行復蘇，白藜蘆醇卵巢組置于含有5 μmol·L-1白藜蘆醇的復蘇液中復蘇后立即進行移植。

1.4 新生小鼠卵巢異體腎被膜下移植選取6 周齡CD-1雌鼠10只作為受體鼠，腹腔注射240 mg/kg阿弗丁給小鼠進行麻醉，將復蘇后的同1只小鼠的卵巢組織（1只卵巢為模型對照組，另1只卵巢為白藜蘆醇組）分別移到受體鼠的兩側腎被膜下，同時摘除受體鼠雙側卵巢[5]。送回動物中心飼養，于移植后第5天取材5 只，移植后第14天取材5 只，取出移植卵巢，采用中性福爾馬林溶液固定卵巢組織后石蠟包埋切片（厚5 μm）。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 TUNEL FITC 染色法觀察卵巢組織細胞凋亡 按照TUNEL FITC 諾維贊A111-01 說明書操作染色，熒光顯微鏡下拍照。

1.5.2 免疫組織化學染色法檢測卵巢組織Cleaved-Caspase-3 表達 將石蠟組織切片于65 ℃烘箱中烘干后，放置于二甲苯、梯度乙醇中各2 min，單蒸水清洗2 次，采用3%過氧化氫-甲醇去除內源性過氧化物。然后在檸檬酸鈉抗原修復液中煮沸15 min，山羊血清室溫封閉。加入Cleaved-Caspase-3抗體，4 ℃濕盒過夜，TBS清洗，加入二抗孵育1 h，TBS 清洗，加入三抗孵育1 h 后，清洗。DAB顯色后蘇木素染色，正置顯微鏡下拍照。

1.5.3 小鼠卵巢組織連續切片后卵泡總數及各級卵泡數的記錄 異體移植后的卵巢組織連續切片后，進行HE 染色，置于顯微鏡下觀察，統計各級卵泡數量。根據文獻研究[5]標準，按照細胞核計數，扁平顆粒細胞為原始卵泡，一層立方形顆粒細胞為初級卵泡，一層以上立方形顆粒細胞為次級卵泡，出現腔隙為有腔卵泡。正常卵泡呈圓形，顆粒細胞分布均勻。異常卵泡卵母細胞不完整或消失，顆粒細胞排列不規則，部分脫落，部分可見卵母細胞核固縮或皺縮[6]。

1.5.4 Western Blot法檢測復蘇卵巢中蛋白表達的變化 提取卵巢組織總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定樣本的蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，聚偏氟乙烯（PVDF）轉膜，脫脂奶粉封閉后，加入兔源Nrf2 抗體（1∶800 稀 釋）、HO-1 抗 體（1∶800 稀 釋）、Cleaved-Caspase-3 抗體（1∶800 稀釋）、PARP 抗體（1∶800 稀釋）、Cleaved-PARP（1∶800 稀釋）以及β-tubulin 抗體（1∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育1 h后，加入ECL發光液顯影。采用圖像分析軟件對條帶進行灰度分析，量化目的蛋白的表達。

1.6 統計方法采用Graphpad Prism 6.0 軟件進行統計學分析。結果數據以均數± 標準差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對冷凍復蘇后卵巢組織中細胞凋亡的影響圖1結果顯示，冷凍復蘇處理后的卵巢組織（模型對照組）出現TUNEL 熒光信號強度，隨著白藜蘆醇處理濃度（0.5、2.5、5 μmol·L-1）的增加，TUNEL 熒光信號強度逐漸降低，表明白藜蘆醇可以降低冷凍復蘇后卵巢組織中的細胞凋亡，并呈濃度依賴性，確定后續實驗的白藜蘆醇處理濃度為5 μmol·L-1。

圖1 TUNEL熒光染色檢測卵巢組織細胞凋亡結果Figure 1 Results of TUNEL fluorescence staining detecting apoptosis in ovarian tissue

2.2 白藜蘆醇對冷凍復蘇后卵巢組織中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表達的影響圖2結果顯示，冷凍復蘇處理后的卵巢組織（模型對照組）出現凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3 陽性細胞數增加（P＜0.05）。加入5 μmol·L-1白藜蘆醇處理后，白藜蘆醇組凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3 陽性細胞數較模型對照組顯著減少（P＜0.01），表明冷凍復蘇對新生小鼠卵巢組織造成了凋亡損傷，白藜蘆醇可以抑制冷凍復蘇過程中卵巢組織凋亡。

圖2 卵巢組織Cleaved-Caspase-3免疫組織化學染色結果Figure 2 Immunohistochemical staining results of ovarian tissue for Cleaved-Caspase-3

2.3 白藜蘆醇對冷凍復蘇后卵巢組織中卵泡存活的影響圖3、表1 和圖4、表2 結果顯示，白藜蘆醇5 μmo·L-1組卵巢移植5、14 d 后的卵泡總存活率較模型對照組均明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。移植5 d后進行卵泡計數發現，白藜蘆醇5 μmol·L-1組原始卵泡存活率較模型對照組均明顯改善（P＜0.05）。移植14 d 后各級卵泡計數顯示，白藜蘆醇5 μmol·L-1組初級卵泡、竇卵泡存活率較模型對照組均明顯增加（P＜0.05）。表明白藜蘆醇可以增加冷凍復蘇后卵巢組織中卵泡的數量，減少冷凍復蘇中卵泡的丟失，改善移植卵巢組織卵泡的存活率，卵泡后期發育情況優于模型對照組。

圖3 卵巢移植5 d后HE染色結果（×20）Figure 3 HE staining results at 5 days after ovarian transplantation（×20）

圖4 卵巢移植14 d后HE染色結果Figure 4 HE staining results at 14 days after ovarian transplantation

表1 卵巢移植5 d后各級卵泡計數結果Table 1 Follicle count results at all levels at 5 days after ovarian transplantation（±s，n=5）

注：卵泡存活率=存活卵泡數/總卵泡數×100%。①P＜0.05，與模型對照組比較

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表2 卵巢移植14 d后各級卵泡計數結果Table 2 Follicle count results at 14 days after ovarian transplantation （±s，n=5）

表2 卵巢移植14 d后各級卵泡計數結果Table 2 Follicle count results at 14 days after ovarian transplantation （±s，n=5）

注：卵泡存活率=存活卵泡數/總卵泡數×100%。①P＜0.05，與模型對照組比較

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2.4 白藜蘆醇對冷凍復蘇后卵巢組織中Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達的影響圖5結果顯示，新鮮的小鼠卵巢組織經過冷凍復蘇損傷后，模型對照組凋亡蛋白Cleaved-PARP/PARP 比值明顯增加，抗氧化蛋白Nrf2、HO-1 表達水平顯著降低，與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。卵巢組織經過冷凍復蘇并移植5 d后，白藜蘆醇處理組抗氧化蛋白Nrf2 表達水平明顯升高，凋亡蛋白Cleaved-PARP/PARP 比值明顯減低，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），HO-1 表達水平升高，但與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明白藜蘆醇可以通過Nrf2/HO-1 信號通路減輕冷凍復蘇后卵巢組織氧化應激損傷。

圖5 各組卵巢組織Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白檢測結果Figure 5 Determination results of Nrf2/HO-1 signaling pathway related proteins in ovarian tissue

3 討論

生殖醫學的快速發展促進了各種生育力保存技術的進步。胚胎、卵母細胞和卵巢皮質的冷凍保存可以使女性腫瘤患者在癌癥治愈后繼續生育[7]。但胚胎冷凍法在青春期前和無配偶的女性腫瘤患者中應用，卵母細胞冷凍也還尚未完全成熟。成熟卵母細胞在冷凍復蘇過程中存在著細胞紡錘體、細胞骨架和透明帶的損傷，存在潛在的子代遺傳安全隱患[8]。冷凍卵巢組織經復蘇處理后可以通過原位或異位移植重建卵巢功能。卵巢皮質冷凍復蘇移植后，卵泡可以自然發育并排卵。截至2017 年，全世界已經有80 多例應用該方法的嬰兒出生[9]。然而，卵巢皮質冷凍技術存在一定的技術難度，并未得到廣泛應用。同時，在皮質復蘇和移植過程中會損失大量的原始卵泡，影響治療效果[10]。卵巢組織復蘇移植過程中，復蘇回移的組織中會產生大量的氧自由基，引起卵泡的閉鎖和卵巢間質細胞的大量損傷。此外，移植后新生血管再灌注也會促使移植卵巢組織中產生氧自由基、炎癥遞質等，進一步造成卵泡與卵巢間質細胞的凋亡[11]。因此，如何降低回移卵巢組織的氧化應激十分重要。

Nrf2是一種廣泛存在于各種組織細胞中的轉錄因子，其表達水平與氧化應激水平有關，能夠調節炎癥與氧化應激基因的表達，在機體抗氧化應激損傷中起著重要的作用；HO-1 是血紅素分解代謝過程中的限速酶，可降解血紅素為一氧化碳、膽綠素和亞鐵離子，是Nrf2 發揮抗炎和抗氧化作用的關鍵分子[12]。Nrf2/HO-1 途徑是機體氧化應激調控的重要信號通路，活性氧（ROS）的大量產生可使損傷組織Nrf2 表達升高，激活下游抗氧化基因HO-1 表達進而增強細胞的抗氧化應激能力[13]。動物實驗表明，Nrf2/HO-1 級聯反應對缺血再灌注損傷過程中的氧化應激和炎癥反應均具有顯著的抑制效果，當Nrf2/HO-1 表達上調時，ROS 水平降低，炎癥因子的產生顯著減少[14]。

白藜蘆醇為含有二苯乙烯結構的多酚類化合物，其在神經系統、心腦血管系統、腫瘤、炎癥等方面均有廣闊的應用前景[3]。近年來白藜蘆醇在生殖力保存中，也有廣泛的報道。在精液冷凍保護液中添加白藜蘆醇可以通過降低精子內ROS 水平減少精子冷凍損傷，從而改善解凍后精子的質量和功能[15]。在凍融小鼠卵巢組織自體移植中，白藜蘆醇可以通過下調NF-κB，從而減少炎癥因子IL-6 的產生，減少卵巢組織自體移植的卵泡丟失，白藜蘆醇還可以通過增加超氧化物歧化酶（SOD）的表達、減少丙二醛（MDA）的產生，防止細胞膜脂質過氧化對卵母細胞的損傷[16]。在胚胎玻璃化冷凍復蘇中，白藜蘆醇可以改善玻璃化冷凍-解凍后胚胎線粒體分布異常和功能損傷[17]。此外，白藜蘆醇還可以通過增加線粒體DNA（mtDNA）拷貝數和ATP 含量改善卵母細胞成熟率、受精率和優質胚胎率[18]。但是，白藜蘆醇對新生小鼠卵巢冷凍復蘇的保護作用及其對Nrf2/HO-1 通路的調控作用尚未見報道。為了研究白藜蘆醇處理的冷凍復蘇新生小鼠卵巢中卵泡的長期發育情況，需要將新生小鼠卵巢組織進行異體移植后體內發育。由于新生小鼠卵巢組織較小，無法進行卵巢組織原位移植，而腎被膜下血管豐富，移植卵巢活動區域較為局限，手術切口損傷小，被認為是動物卵巢移植的適宜部位之一[19]。本研究結果顯示，與模型對照組比較，白藜蘆醇處理組的冷凍復蘇卵巢中細胞凋亡明顯減少，卵泡存活率增加，凋亡標志蛋白Cleaved-PARP 及Cleaved-Caspase-3 表達明顯降低，證明白藜蘆醇可以通過降低卵巢組織的凋亡水平來提高冷凍復蘇后卵泡的存活率。Western Blot 結果證實，抗氧化蛋白Nrf2、HO-1 表達明顯增強，提示卵巢組織的抗凋亡保護作用與Nrf2/HO-1 信號通路有密切的關系。

綜上所述，在卵巢冷凍前用白藜蘆醇對卵巢組織進行預處理，并在卵巢冷凍液及復蘇液中同時加入白藜蘆醇后，異體移植的冷凍復蘇卵巢組織凋亡水平降低，卵泡存活率增加。本研究成果可為白藜蘆醇作為臨床中卵巢組織冷凍保護劑的開發提供一定的理論依據。但白藜蘆醇在卵巢組織冷凍復蘇中的臨床應用，還需要進一步深入研究。