貝萊斯芽孢桿菌微膠囊制備及其防治番茄枯萎病的應(yīng)用評價(jià)

彭啟超　張志鵬　黃德龍　魏浩　李俊　王瑩　鄧祖科　王宗抗

摘要 以前期分離篩選獲得的生防菌貝萊斯芽孢桿菌DTP-03為研究對象，將其制備成貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑，并通過隨機(jī)質(zhì)心對微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終微膠囊的制備條件：海藻酸鈉濃度為2.05%，氯化鈣濃度為1.90%，殼聚糖濃度為0.85%，菌液：海藻酸鈉為1∶2.5，經(jīng)測定其微膠囊包埋率可達(dá)99.0%以上。貝萊斯芽孢桿菌DTP-03微膠囊的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，在不添加任何保護(hù)劑的條件下35 d后，貝萊斯芽孢桿菌活菌數(shù)的保存率為79.91%。通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其對番茄枯萎病的防治效果，盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌DTP-03微膠囊菌劑對番茄枯萎病的防效達(dá)76.00%，相比于未包膜的菌體，應(yīng)用后防效提升了18.75%，表明微膠囊包膜技術(shù)能提升貝萊斯芽孢桿菌的生防效果，為今后貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑的應(yīng)用開發(fā)提供一定的前期基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞貝萊斯芽孢桿菌；微膠囊；隨機(jī)質(zhì)心映射優(yōu)化；番茄枯萎病；防效

中圖分類號S436.412文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0152-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.035開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Preparation of Bacillus velezensis Microcapsules and Its Application Evaluation on the Control of Fusarium wilt of Tomato

PENG Qi-chao ZHANG Zhi-peng HUANG De-long et? al（1.Beijing Long Age AMMS Biological Technology Co.，Ltd.，Beijing 101200；2.Shenzhen Batian Ecotypic Engineering Co.，Ltd.，Shenzhen，Guangdong 518105）

AbstractIn this study，the biocontrol bacterium Bacillus velezensis DTP-03 obtained in the early stage was selected as the research object.It was prepared into Bacillus velezensis microcapsule，and the preparation process of microcapsule was optimized by random centroid.The final preparation conditions of the microcapsule were as follows：the concentration of sodium alginate was 2.05%，the concentration of calcium chloride was 1.90%，the concentration of chitosan was 0.85%，and the concentration of bacterial solution：sodium alginate was 1∶2.5.The embedding rate of the microcapsule was determined to be more than 99.0%.The stability test data of Bacillus velezensis DTP-03 microcapsule showed that after 35 days without adding any protective agent，the preservation rate of Bacillus velezensis viable bacteria was 79.91%.Finally，the pot experiment was conducted to verify its control effect on Fusarium wilt of Tomato.The results of the pot experiment showed that the control effect of Bacillus velezensis DTP-03 microcapsule on Fusarium wilt of tomato reached 76.00%，and the control effect increased by 18.75% compared with the uncoated bacteria，indicating that the microcapsule coating technology can improve the biocontrol effect of Bacillus velezensis，it provides a certain preliminary basis for the application and development of Bacillus velezensis microcapsules in the future.

Key wordsBacillus velezensis;Microcapsule;Random-centroid optimization;Fusarium wilt of tomato;Control effect

植物病害是威脅農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)的重要因素，化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用使得病原菌產(chǎn)生一定抗藥性，同時(shí)對人、畜和環(huán)境產(chǎn)生了危害，由農(nóng)藥引起的食品安全和環(huán)境污染問題已經(jīng)受到廣泛關(guān)注［1-2］。因此，采用高效、低毒、環(huán)境友好的治理技術(shù)替代傳統(tǒng)單一依靠化學(xué)農(nóng)藥來防治植物病害是生產(chǎn)中亟待解決的問題［3］。

芽孢桿菌具有繁殖快、抗逆性強(qiáng)、殺菌效果好、且能誘導(dǎo)植物抗病性及促生增產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在植物病害生物防治中被廣泛研究和應(yīng)用［4-5］。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是一種新型生防細(xì)菌，由Ruiz-García等［6］在2005年發(fā)現(xiàn)并命名，其作為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，因其具有豐富的代謝產(chǎn)物和生理功能而受到學(xué)者們更多的青睞［7］。李生樟等［8］研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌 504 能夠抑制水稻細(xì)菌性條斑病菌在水稻葉片中的生長，也有研究表明貝萊斯芽孢桿菌在防治黃瓜霜霉病、馬鈴薯瘡痂病和早疫病等方面也具有較好的應(yīng)用潛力［9-11］。然而生防微生物在土壤中發(fā)揮功效的必要條件就是保障其在環(huán)境中的存活率和穩(wěn)定性［12］，現(xiàn)階段，微膠囊技術(shù)是維持微生物的菌存活率和菌穩(wěn)定性的較好方法之一［13］。生物微膠囊是將微生物包埋在合適的成膜材料中，從而可以有效地保護(hù)菌體活性及囊內(nèi)其他活性物質(zhì)的有效性，避免外界環(huán)境不良因素的傷害和噬菌體的入侵，提高菌體在冷凍、儲(chǔ)存和定殖過程的存活率 ［14-15］，利用生物微膠囊技術(shù)與生防微生物菌種相結(jié)合制備成效果更優(yōu)的生防菌劑是未來的發(fā)展趨勢。

因此，筆者以北京世紀(jì)阿姆斯生物工程有限公司前期分離篩選獲得的生防菌貝萊斯芽孢桿菌DTP-03為研究對象，將其制備成貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑，并對微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，隨后通過盆栽試驗(yàn)測定貝萊斯微膠囊菌劑對番茄枯萎病的防治功效，為今后貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑的應(yīng)用開發(fā)提供一定的前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。番茄枯萎病病原菌（Fusarium oxysporumf.sp lycopersici，F(xiàn)ol）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。貝萊斯芽孢桿菌DPT-03菌株由北京世紀(jì)阿姆斯生物工程有限公司從土壤中分離并保存。

1.1.2培養(yǎng)基配制。LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基的配制參考方中達(dá)［16］的方法。

1.2方法

1.2.1菌株活化。吸取凍干管中保存的貝萊斯芽孢桿菌DTP-03 1 mL，加入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，隨后放置搖床中120 r/min、32 ℃培養(yǎng)24 h，然后取活化菌液涂布到LB固體培養(yǎng)基平板中，放至培養(yǎng)箱，32 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落無雜菌，保存?zhèn)溆谩Ｎ龈晒苤斜４娴姆芽菸〔≡? mL，加入到100 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，隨后放置搖床中120 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h，然后取活化菌液涂布到PDA固體培養(yǎng)基平板中，放至培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落無雜菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑的制備。以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材，以貝萊斯芽孢桿菌DPT-03為芯材，用擠壓法制備貝萊斯芽孢桿菌-海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊，制備方法：取適量的菌液與滅菌的海藻酸鈉溶液混合均勻后，在攪拌速度為400 r/min的情況下，用直徑0.45 mm的無菌注射器將此混合液滴加到CaCl2溶液中，固化30 min后，用無菌水洗滌2次后收集微膠囊，洗滌液收集備用。將收集的微膠囊在攪拌速度為600 r/min的條件下加至殼聚糖溶液中覆膜40 min后洗滌2次，4 ℃保存，洗滌液收集備用。

1.2.3RCO優(yōu)化微膠囊制備的隨機(jī)選擇。影響微膠囊內(nèi)活菌數(shù)的因子包括海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、氯化鈣濃度、菌液與海藻酸鈉混合比等因素，設(shè)定4個(gè)因素及其變化范圍，分別為海藻酸鈉濃度1.0%～2.5%；氯化鈣濃度1.0%～2.5%；殼聚糖濃度0.5%～1.5%；菌液/海藻酸鈉（V/V）0.16～1.00。優(yōu)化指標(biāo)設(shè)定為每粒微膠囊內(nèi)的總活菌數(shù)。將以上影響因素及其變化范圍輸入到RCO程序并運(yùn)行，隨機(jī)選擇得到的微膠囊制備條件見表1，并根據(jù)表1的優(yōu)化方案進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4RCO優(yōu)化微膠囊制備的質(zhì)心選擇和映射優(yōu)化。將隨機(jī)選擇的試驗(yàn)結(jié)果輸入到RCO程序進(jìn)行質(zhì)心選擇，得到針對每種檢測目標(biāo)的優(yōu)化方案，并按照方案進(jìn)行。根據(jù)質(zhì)心選擇試驗(yàn)得到的發(fā)酵目標(biāo)值分別輸入RCO程序中并進(jìn)行映射優(yōu)化，針對每一個(gè)發(fā)酵目標(biāo)給出一個(gè)最佳發(fā)酵方案。

1.2.5微膠囊包埋率的測定。微膠囊的包埋率是微膠囊所包埋的活菌數(shù)占總活菌數(shù)的百分比。微膠囊制備后，溶液內(nèi)、膠囊表面和內(nèi)部都含有活菌，測定其所有的活菌數(shù)即為總菌數(shù)；測定溶液內(nèi)以及微膠囊表面的活菌數(shù)即為未包埋的活菌數(shù)；總菌數(shù)與未包埋的活菌數(shù)之差即為微膠囊所包埋的活菌數(shù)。包埋率計(jì)算公式：

微膠囊包埋率=（總活菌數(shù)-未包埋的總活菌數(shù)）/總活菌數(shù)×100%

1.2.6生物微膠囊存儲(chǔ)穩(wěn)定性的測定。將微膠囊與菌液均于4 ℃保存，每隔7 d采用平板稀釋法檢測一次微膠囊及菌液中的菌體濃度，連續(xù)測定35 d。

1.2.7生物微膠囊菌劑在盆栽試驗(yàn)中防病能力的測定。將番茄苗播種于滅菌基質(zhì)中，當(dāng)番茄苗長出6片真葉時(shí)，進(jìn)行移苗。采用直徑約15 cm的塑料盆，盆底墊20目尼龍網(wǎng)，每盆裝土約2 kg，將番茄苗移栽至盆中，每盆3株。使用20 mL番茄枯萎病病原菌孢子液對每株番茄植株進(jìn)行灌根，24 h后添加相應(yīng)菌劑，試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)9盆。處理①添加貝萊斯微膠囊菌劑10粒，微膠囊濃度為10-7 CFU/粒；處理②添加貝萊斯芽孢桿菌菌懸液1 mL（菌懸液濃度為10/mL）；處理③清水對照。期間澆水、追肥、防治病蟲害等管理措施一致，待番茄苗生長30 d后調(diào)查病情，計(jì)算發(fā)病率及防效，計(jì)算公式：

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

防效=（對照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率）/對照組發(fā)病率×100%

1.3數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和Prism-GraphPad 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2結(jié)果與分析

2.1RCO隨機(jī)優(yōu)化結(jié)果根據(jù)RCO隨機(jī)選擇給出的微膠囊制備優(yōu)化方案，進(jìn)行微膠囊制備試驗(yàn)，在各組微膠囊制備結(jié)束時(shí)，測定各組的總活菌數(shù)。各試驗(yàn)組的活菌數(shù)見圖1，9號配方具有最高的菌數(shù)，平均可達(dá)5.67×10 CFU/粒，4號配方微膠囊成型效果最差，菌數(shù)最少，僅為0.33×10CFU/粒。

2.2RCO質(zhì)心優(yōu)化結(jié)果將隨機(jī)選擇的試驗(yàn)結(jié)果輸入到RCO程序進(jìn)行質(zhì)心選擇，得到針對每種檢測目標(biāo)的優(yōu)化方案，并按照方案進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化方案見表2。根據(jù)質(zhì)心選擇的條件進(jìn)行試驗(yàn)得到相應(yīng)試驗(yàn)組的總活菌數(shù)（圖2），結(jié)果表明4號方案中海藻酸鈉濃度為2.05%，氯化鈣濃度為1.90%，殼聚糖濃度為0.85%，菌液/海藻酸鈉為0.40時(shí)具有更多的活菌數(shù)，可達(dá)6.34×10 CFU/粒。

2.3RCO映射優(yōu)化結(jié)果將質(zhì)心選擇得到的目標(biāo)值再次分別輸入RCO程序中進(jìn)行映射優(yōu)化，針對每個(gè)目標(biāo)給出一個(gè)最佳試驗(yàn)方案，映射優(yōu)化結(jié)果見圖3。由圖3可知，在微膠囊的制備過程中海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度和菌液與海藻酸鈉比的趨勢線均比較集中，表明海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度和菌液與海藻酸鈉比對微膠囊活菌數(shù)的影響最為顯著，而氯化鈣濃度并不是影響菌數(shù)的主要因子。根據(jù)RCO優(yōu)化結(jié)果，最終微膠囊的制備條件：海藻酸鈉濃度為2.05%，氯化鈣濃度為1.90%，殼聚糖濃度為0.85%，菌液∶海藻酸鈉為1∶2.5。

2.4微膠囊包埋率與存儲(chǔ)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明制備貝萊斯芽孢桿菌微膠囊過程中包埋率可達(dá)99.0%以上，生物微膠囊的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見圖4，在不添加任何保護(hù)劑的條件下35 d后，貝萊斯芽孢桿菌活菌數(shù)的保存率為79.91%。

2.5貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑防病能力評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果表明，接種番茄枯萎病菌后，處理①的防效為76.00%，處理②的防效為64.00%。同樣施用貝萊斯芽孢桿菌的處理①和處理②相比，利用微膠囊技術(shù)包膜后的貝萊斯芽孢桿菌的防效提升了18.75%，表明貝萊斯芽孢桿菌生物微膠囊對番茄枯萎病具有良好的生防效果，且采用微膠囊技術(shù)包膜后的防效更優(yōu)（表3）。

3結(jié)論與討論

微膠囊技術(shù)是指使用聚合物基質(zhì)將具有功能性的生物活性材料包裹制備成微觀容器的一種手段，微膠囊技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物遞送、生物活性物質(zhì)保護(hù)以及益生菌類產(chǎn)品開發(fā)等領(lǐng)域［17-18］。微膠囊主要是通過不同壁材的優(yōu)化選擇來保證芯材的生理生化性能，良好的壁材能夠保護(hù)芯材不受外部環(huán)境因素的損害［19-20］。海藻酸鈉由于其優(yōu)良的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性以及生物相容性，是良好的微膠囊外殼組成物質(zhì)，而且海藻酸鈉儲(chǔ)量豐富、可再生，海藻酸鈉制備的微膠囊被廣泛應(yīng)用［21］。

海藻酸鈉分子與殼聚糖分子在特定條件下會(huì)發(fā)生復(fù)合凝聚，隨著在溶液中的溶解度降低，包覆在芯材周圍凝聚形成微囊［22］。該研究采用海藻酸鈉-殼聚糖作為其壁材，將前期獲得的生防貝萊斯芽孢桿菌DPT-03制備成生物微膠囊菌劑，并采用隨機(jī)質(zhì)心映射優(yōu)化技術(shù)將制備過程中各影響因素的條件進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得最優(yōu)的微膠囊制備條件：海藻酸鈉濃度為2.05%，氯化鈣濃度為1.90%，殼聚糖濃度為0.85%，菌液∶海藻酸鈉為1∶2.5。表明氯化鈣-海藻酸鈉對固定化有益微生物有較好的保護(hù)作用，在不同生理?xiàng)l件下，益生菌的存活率和功效表現(xiàn)比沒有微囊化的菌體有明顯提升［23-24］。該研究中微膠囊包埋率可達(dá)99.0%以上且在不添加任何保護(hù)劑的條件下35 d后微生物活菌數(shù)的保存率達(dá)79.91%。

喬紫璇［25］將貝萊斯芽孢桿菌FZB42制備成微膠囊能顯著提升菌數(shù)的保藏性，明顯減緩菌數(shù)的下降速率，同時(shí)將貝萊斯芽孢桿菌FZB42和枯草芽孢桿菌168、枯草芽孢桿菌OKB105和假單孢菌Pf-5制備成的復(fù)合微生物膠囊菌劑對紋枯病的防治效果達(dá)81.19%，對稻瘟病的防治效果達(dá)84.78%，具有提升防控效果和作物產(chǎn)量的功效。王琴等［26］研究表明，將短短芽孢桿菌HAB-05、枯草芽孢桿菌A178、萎縮芽孢桿菌制備成微生物膠囊，短短芽孢桿菌HAB-05和枯草芽孢桿菌A178對芒果炭疽病菌防治效果有明顯提升。該研究中貝萊斯芽孢桿菌DPT-03微膠囊菌劑相比于未包膜的菌體防效提升了18.75%，表明貝萊斯芽孢桿菌DPT-03微膠囊包膜能一定程度上提升其對病害的防治效果，為后續(xù)貝萊斯芽孢桿菌微膠囊菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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