基于SCoT標記的胡椒屬藥用植物多樣性分析

零唯　楊丹　譚勇　黃鼎　林敬禎　明如宏

摘要 采用正交設計優化胡椒屬藥用植物SCoT-PCR反應體系，并運用SCoT分子標記對7種胡椒屬藥用植物31份樣品進行遺傳多樣性研究。結果表明，胡椒屬藥用植物SCoT-PCR最佳反應體系：總體積20 μL，其中10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.4 μmol/L，模板DNA 100 ng，Taq聚合酶2.5 U。擴增總條帶數為68條，其中多態性條帶為64條，多態性比率為94.12%。31份胡椒屬藥用植物個體間聚類分析結果顯示，31份胡椒屬樣品劃分為2個類群，6個亞群。SCoT可適用于胡椒屬藥用植物遺傳多樣性研究。

關鍵詞胡椒屬；SCoT；正交優化；遺傳多樣性

中圖分類號Q949.732.3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0182-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.042開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Diversity Analysis of Piper Medicinal Plants Based on SCoT Markers

LING Wei YANG Dan TAN Yong et al（1.Institute of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530000;2.Guangxi Key Laboratory of Zhuang and Yao Ethnic Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530200）

AbstractThe SCoT-PCR reaction system of medicinal plants of Piper was optimized by orthogonal design，and the genetic diversity of 31 samples of 7 species of medicinal plants of Piper was studied by SCoT molecular markers.The results showed that the best SCoT-PCR reaction system of Piper was as follows： the total volume was 20 μL，of which 10 × buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，primer 0.4 μmmol/L，template DNA 100 ng，Taq polymerase 2.5 U.The total number of amplified bands was 68，of which 64 were polymorphic，with a polymorphism rate of 94.12%.The clustering results showed that 31 samples of Piper were divided into 2 groups and 6 subgroups.SCoT can be used to study the genetic diversity of medicinal plants of Piper.

Key wordsPiper;SCoT;Orthogonal optimization;Genetic diversity

胡椒屬（Piper）為胡椒科（Piperaceae）最大的屬之一，在全球約有2 000 多種，主要分布在熱帶和亞熱帶地區［1］，我國有60多種，其中30多種入藥，主要產地為云南、廣東、廣西、海南等省區［2］。胡椒屬藥用植物具有重要的藥用價值，在民間多用作止痛、活血和抗風濕性疾病藥物［3］，現代研究表明其具有抗菌、抗抑郁、抗血栓等藥理作用［4-6］。除藥用外，胡椒屬藥用植物還作為調味品用于食品烹飪以及芳香性精油用于香水工業中［7-8］。由于胡椒屬藥用植物野生種類分布范圍狹小、資源稀少［9］，為有效保護和利用胡椒屬藥用植物資源，有必要對胡椒屬藥用植物遺傳多樣性進行研究。

起始密碼子多態性（start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard等［10］根據植物基因組ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性而開發的一種目的基因分子標記，其具有操作簡單、引物通用性強、遺傳信息豐富、多態性好等優點，目前已成功應用于梔子［11］、地黃［12］、秦艽［13］等藥用植物的遺傳多樣性研究。因此，該試驗運用SCoT標記技術對31份胡椒屬藥用植物樣品進行遺傳多樣性分析，挖掘胡椒屬藥用植物遺傳信息，為胡椒屬藥用植物的種質選育和資源保護提供理論參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料該試驗采集31份胡椒屬藥用植物新鮮嫩葉為供試材料，采集樣品經廣西中醫藥大學藥用植物教研室戴忠華副教授鑒定，其中29份材料采自廣西各地，2份材料采自海南，樣品信息見表1。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取及質量測定。參照天根多糖多酚提取植物基因組DNA試劑盒提取步驟對胡椒屬藥用植物DNA進行提取，將符合要求的DNA溶液稀釋至50 ng/μL，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2單因素考察。參照尚小紅等［14］的研究，設定SCoT-PCR初始擴增反應體系：總體積20 μL，10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg 1.5 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，模板DNA 50 ng，Taq聚合酶1 U，剩余部分用ddHO補齊，其中DNA模板為假蔞J10，引物為SCoT 21；擴增程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。對SCoT反應體系中的dNTPs濃度、Mg濃度、引物濃度、模板DNA用量以及Taq聚合酶量進行單因素考察，每個因素設置6個梯度水平，見表2。

1.2.3正交優化試驗。根據單因素試驗結果，設計L16（45）正交表優化SCoT-PCR反應體系，每處理2次重復（表3）。正交試驗的反應體系以及反應程序與單因素試驗相同。

1.2.4引物篩選以及退火溫度的優化。采用優化后的反應體系對61條SCoT引物進行篩選，引物選用 Collard等［10］開發設計SCoT的引物。選用PCR儀的退火溫度梯度模式，設置溫度區間為引物TM值±5 ℃，對引物進行退火溫度優化。

1.2.5SCoT-PCR擴增與數據處理。利用篩選出的引物對31份胡椒屬藥用植物進行擴增。對擴增結果進行條帶統計，建立0/1矩陣。利用POPGENE 3.2軟件進行分析獲得遺傳相似系數，采用NTSYS 2.10軟件對胡椒屬7個品種31份樣品進行聚類分析。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1dNTPs濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響。如圖1所示，6條泳道均能擴增出條帶。dNTPs濃度在0.15～0.30 mmol/L，條帶清晰可辨，亮度適中；當濃度在0.35～0.40 mmol/L，條帶出現彌散現象，清晰度下降。因此選定0.15～0.30 mmol/L 為正交優化試驗梯度水平。

2.1.2Mg濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖2可以看出，Mg濃度在1.5～2.5 mmol/L時，條帶較為清晰，分離度較好；當Mg濃度為3.5 mmol/L時，雖擴增條帶數量多、亮度適中，但與1.5、2.0 mmol/L相比，無明顯優勢。為了節約成本，因此選擇1.5～3.0 mmol/L為正交優化試驗梯度水平。

2.1.3引物濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖3可以看出，當引物濃度在0.3～0.6 μmol/L時，隨著濃度的增加，擴增條帶亮度、清晰度隨之增強；當濃度超過0.7 μmol/L時，部分條帶出現黏連情況，無法區分。因此選用0.3～0.6 μmol/L為正交優化試驗梯度水平。

2.1.4模板DNA用量對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖4可以看出，模板DNA用量為25和150 ng時，條帶彌散、模糊；用量為50～125 ng，擴增譜帶相似，譜帶清晰且數量較多。綜合考慮，選擇50～125 ng為正交優化試驗梯度水平。

2.1.5Taq聚合酶用量對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖5可以看出，當Taq聚合酶用量為0.5和3.0 U時，部分條帶存在模糊現象；當用量為1.0～2.5 U時，擴增條帶較為清晰，條帶帶型差異性較小。因此選擇1.0～2.5 U為正交優化試驗梯度水平。

2.2SCoT正交試驗正交電泳結果（圖6）表明在16個組合2次重復中，所有的組合均能擴增出條帶，大小在250～2 000 bp。從圖6可以看出，16個組合對擴增結果的影響存在一定的差異。組合1和14都存在只擴增出2條條帶的情況；組合2、3、7、8、9、11、12、13、14、15、16條帶模糊；組合5、6擴增結果較好，條帶清晰，分離度、亮度適中。其中組合5的2次擴增結果較為穩定，因此選擇組合5為SCoT-PCR最佳反應組合，SCoT-PCR最佳反應體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.20 mmol/L、Mg 1.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、模板DNA 100 ng、Taq聚合酶2.5 U，用無菌水補足20 μL。

2.3引物篩選以及最佳退火溫度的確定依據正交優化得到的最佳反應體系，對61條SCoT引物進行篩選試驗。對各引物擴增結果進行評價，其中有9條引物能夠擴增出清晰且多態性較好的條帶，引物信息及其最佳退火溫度見表4。

2.4SCoT擴增結果及多態性分析對31份胡椒屬藥用植物總DNA進行擴增，部分擴增圖如圖7所示。擴增結果如表5所示，9條引物擴增出68條條帶；引物SCoT 24、SCoT 45、SCoT 49擴增條帶數量最多，SCoT 61和SCoT 63最少；多態性條帶為64條，多態性比率為94.12%。

2.5遺傳相似性分析及聚類分析利用NTSYS 2.10軟件算出31份胡椒屬藥用植物的遺傳相似系數在0.37～0.91。其中親緣關系最近的2份植物分別為采自廣西中醫藥大學仙葫校區的假蔞J1與廣西民族大學相思湖校區的假蔞J2，遺傳相似系數為0.91；而親緣關系最遠的2份植物分別為廣西南寧市賓陽縣思隴鎮水村的風藤F2和廣西桂平市蒙圩鎮新陽村龍潭山的假蔞J12，遺傳相似系數為0.37。

聚類分析結果（圖8）顯示，當遺傳相似系數0.54為閾值時，可將31份胡椒屬植物分為2個大類，其中假蔞、蓽茇、大葉蒟、苧葉蒟、胡椒聚為一類，蓽茇、風藤、山蒟聚為一類；遺傳相似系數為0.63時，大葉蒟單獨聚為一類；胡椒和苧葉蒟在遺傳相似系數為0.68時，可分為2個亞類。

3討論與結論

SCoT標記是Collard等［10］開發的一種新型基因分子標記技術，具有操作簡單、重復性好、遺傳信息豐富、多態性好等優點，可以作為其他分子標記技術的有效補充［15］。SCoT分子標記技術已經應用于許多藥用植物種屬的遺傳多樣性分析中。程虎印等［16］采用 SCoT 分子標記技術對陜西產重樓屬 6 個類群 48 份樣品進行遺傳多樣性分析，結果顯示重樓屬植物在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。馬利奮等［17］采用SCoT分子標記對 17 個枸杞品種進行遺傳多樣性分析，聚類分析結果顯示可將17個枸杞品種分為3個群類。陳大霞等［18］采用 SCoT 分子標記分析 4 種黃連屬藥用植物的遺傳多樣性，揭示出黃連屬藥用植物具有豐富的遺傳多樣性，種間存在高度的遺傳分化。

SCoT聚類分析顯示山蒟和風藤為一類，說明這2個品種遺傳差異性小、親緣關系接近。這與蔡誠誠等［19］基于ITS序列分析的研究結果相似，該研究發現風藤與山蒟的同源性高達97.65%，在形態和化學成分組成上也具有較高的相似度。由于在進行植物的遺傳多樣性分析時，所用材料的品種數量、樣品數量和采集區域等因素均會對試驗結果產生影響。該試驗僅研究了31份胡椒屬藥用植物，在后續工作中應當進一步豐富材料來源和數量，從多個層面深入挖掘廣西胡椒屬藥用植物的遺傳信息，為胡椒屬藥用植物種質資源保護與品種選育提供參考。

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