丹瓜護脈顆粒質量標準研究及藥效評價

江 川，黃玉芳，卓 實，章 靚

（福建中醫藥大學附屬人民醫院藥學部，福州 350004）

丹瓜護脈顆粒是福建中醫藥大學附屬人民醫院在特色中藥制劑丹瓜護脈口服液的基礎上研制的，由丹參、赤芍、瓜蔞、川芎等八味中藥組成，具有調節糖脂代謝，抗氧化應激，改善血管功能的作用[1-4]，臨床研究證明丹瓜護脈制劑對糖尿病血管病變具有顯著療效[5-6]，方中丹參活血祛瘀為君藥，赤芍活血散血為臣藥，助君藥活血祛瘀。經查閱文獻[7]，并按照前期預實驗的研究[8]，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）法檢測丹瓜護脈口服液和顆粒劑中的丹酚酸B 與芍藥苷2 種成分，并同時進行抗糖尿病藥效學實驗，為丹瓜護脈制劑新劑型研制提供科學數據。

1 儀器、試藥與實驗動物

1.1 儀器

HP-1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，DAD 二極管陣列檢測器），LE104E 240 電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），超聲波發生器（上海精密儀器儀表有限公司），隨手測血糖儀[強生（中國）醫療器材有限公司]，電熱恒溫水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

丹瓜護脈顆粒由福建中醫藥大學附屬人民醫院藥劑科制劑室制備，批號分別為20210903、20211001、20211002；丹瓜護脈口服液由本院藥劑科制劑室制備，批號分別為20210601、20210602 和20210603。芍藥苷對照品（批號：110736-200424）、丹酚酸B對照品（批號：180208）均購于北京中科質檢生物技術有限公司，含量≥98%；川芎對照藥材（批號：200204）購于北京中科質檢生物技術有限公司；腎上腺素（批號：M08GS147766，購于上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（批號：A104441，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、甲醇（批號：P109359，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）均為色譜級；超純水自制。

1.3 實驗動物

選取SPF 級KM 小鼠，雄性，20 ～22 g，購自北京華埠康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，合格證號：110322210102917173。選取SPF 級C57BL/6 小鼠，雄性，18 ～20 g，購自杭州醫學院，許可證號：SCXK（浙）2019-0002，合格證號：20211117Abzz0100000103；實驗動物飼養于福建省中醫藥研究科學院動物房，室內溫度為25℃，濕度為75%，飼養1 周后使用。本研究已通過倫理委員會審批（動物倫理號：2021068）

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

取川芎5 g，粉碎，取粉末加乙醚 30 mL，加熱回流提取60 min，過濾，將濾液揮干，加2 mL 乙酸乙酯，溶解殘渣，作為供試品溶液。取川芎對照藥材0.5 g，按前述方法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（中國藥典2020 年版）試驗，吸取上述兩種溶液各 2 μL，點于硅膠G 薄層板上，用正己烷-乙酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干后置于紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

圖1 川芎薄層色譜圖

2.2 樣品檢查

按2020 年版《中國藥典（四部）》顆粒劑項下規定，對三批樣品的粒度、水分、溶化性、干燥失重、重金屬、砷鹽進行檢查，結果 三批樣品的檢查結果均符合《2020 年版藥典》顆粒劑項下標準。結果見表1。

表1 三批樣品檢查結果

2.3 芍藥苷和丹酚酸B 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（17:83）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2.3.2 試液配制 取實驗所需的芍藥苷和丹酚酸B對照品，配制的對照品含量：芍藥苷為21.8 μg·mL-1、丹酚酸B 為22.4 μg·mL-1。精密稱取 1 g 的丹瓜護脈顆粒樣品通過乙酸乙酯定容至1 mL，超聲提取后，搖勻，過濾，取續濾液配制供試品溶液。

2.3.3 方法學考察 1）專屬性試驗：上述色譜條件下，色譜圖中兩種對照品相鄰峰分離度均＞1.5；理論塔板數均＞1 萬。色譜圖見圖2。2）線性關系考察：以對照品色譜峰面積（A）為縱坐標，對照品濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，芍藥苷回歸方程為Y= 50.268 6X+ 25.226 4（r= 0.999 9），線性范圍為3.3 ～95 μg·mL-1；丹酚酸B 的回歸方程為Y= 57.946 4X+ 33.184 1（r= 0.999 9），線性范圍為2.5 ～80 μg·mL-1。3）精密度試驗：取芍藥苷和丹酚酸B 的混合對照樣品溶液，每次20 μL，連續進樣6 次，計算結果芍藥苷RSD為2.32%和丹酚酸B 的RSD為2.66%，說明色譜儀精密度良好。4）重復性試驗：取丹瓜護脈顆粒樣品（批號20211001）按設定方法提取和液相分析，計算芍藥苷和丹酚酸B 的RSD分別為2.41%、2.19%，說明該方法的重復性良好。5）加樣回收試驗：取丹瓜護脈顆粒樣品（批號20211001）按設定方法提取和液相分析，結果芍藥苷和丹酚酸B 含量的平均回收率與RSD值分別為97.63%（1.33%）、95.00%（2.43%）。結果見表2。

圖2 專屬性試驗粒HPLC 色譜圖

表2 樣品芍藥苷、丹酚酸B 含量測定結果

2.3.4 樣品測定 批號為20210903、20211001、20211002 丹瓜護脈顆粒樣品中分別取出1 g，按上述顆粒劑溶液樣品的方法制備其對應的試驗溶液，按照上述實驗相同的色譜條件進樣測定，通過外標法計算芍藥苷、丹酚酸B 含量，三批丹瓜護脈顆粒中芍藥苷的含量均＞1.3 mg·g-1，丹酚酸B 含量均＞0.8 mg·g-1。結合實際生產工藝波動，暫擬定丹瓜護脈顆粒制劑質量標準芍藥苷含量不得少于1.0 mg·g-1，丹酚酸B 含量不得少于0.6 mg·g-1。見表3。

表3 樣品芍藥苷、丹酚酸B 含量測定結果 mg·g-1

2.4 抗糖尿病藥效實驗

2.4.1 對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖作用 將購回的小鼠喂養3 d 后，隨機分成6 組，即丹瓜護脈顆粒高、中、低劑量組（ 40 g·kg-1、20 g·kg-1、10 g·kg-1）；丹瓜護脈口服液組（20 mL·kg-1）；空白對照組（等劑量蒸餾水）；陽性對照組（二甲雙胍0.2 g·kg-1）。按照組別連續3 周，每天1 次進行灌胃給藥，最后1次給藥前的0.5 d內不禁水但禁食，給藥后繼續禁食2 h 后測定其空腹血糖，隨即腹腔注射0.4 mg·kg-1的腎上腺素，0.5 h 后測定其血糖。

丹瓜護脈顆粒對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖實驗結果見表4，腎上腺素造模后，給藥組與空白對照組比較，小鼠血糖明顯下降，具有顯著性差異。

表4 丹瓜護脈顆粒對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖實驗結果（±s，n = 10） mmol·L-1

表4 丹瓜護脈顆粒對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖實驗結果（±s，n = 10） mmol·L-1

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別給藥前血糖濃度給藥0.5 h 后血糖濃度顆粒劑高劑量8.610±0.97615.910±2.589#顆粒劑中劑量8.720±0.58716.200±2.338#顆粒劑低劑量7.080±0.88816.440±2.365#口服液組8.060±1.11314.990±2.561##空白組7.930±0.52519.720±3.895陽性組7.756±0.67810.711±2.798##

2.4.2 對鏈脲佐菌素（STZ）高血糖小鼠的降血糖實驗

2.4.2.1 正常動物降糖實驗 選健康成年小鼠按禁食3 ～5 h 的血糖水平分組后，隨機其分為口服液組（20 mL·kg-1）、空白對照組（蒸餾水）和顆粒劑（40 g·kg-1）組。其中口服液組與顆粒劑組分別通過灌胃給高劑量的口服液和顆粒劑，灌胃給藥持續30 d 后測量其空腹血糖值，并分別與空白組比較其血糖濃度差異。丹瓜護脈顆粒與丹瓜護脈口服液對正常小鼠灌胃30 d 血糖變化見表5，丹瓜護脈顆粒劑組血糖明顯升高。

表5 丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對正常小鼠灌胃30 d后的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

表5 丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對正常小鼠灌胃30 d后的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

注：與空白組比較，## P ＜0.01

組別30 d 后血糖濃度顆粒劑組8.870±0.882##口服液組8.060±1.113空白組9.730±0.525

2.4.2.2 高血糖模型動物降糖實驗 購入小鼠喂養3 d 后，隨機取15 只小鼠不禁水但禁食4 h，隨后測量空腹血糖，將此數值作為該批小鼠的基礎血糖值。再將此批小鼠禁食24 h 但不禁水，持續5 d 通過腹腔注射以50 mg·kg-1為體質量劑量的STZ 造以糖尿病小鼠模型。第10 天時測空腹血糖，小鼠血糖值在10 ～25 mmol·L-1則說明造模成功，符合糖尿病模型要求。糖尿病模型小鼠按血糖水平隨機分為丹瓜護脈顆粒高、中、低劑量組（40 g·kg-1、20 g·kg-1、10 g·kg-1）；丹瓜護脈口服液高、中、低劑量組（20 mL·kg-1、10 mL·kg-1、5 mL·kg-1）；空白對照組（等劑量蒸餾水）；陽性對照組（二甲雙胍0.2 g·kg-1）；組間差≤1.1 mmol·L-1。連續灌胃30 d。第30 天時禁食4 h，隨后測量其空腹血糖值并相互比較。丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對高血糖模型小鼠的血糖影響見表6。持續灌胃30 d 后血糖濃度穩定，與空白組比較血糖濃度明顯下降。

表6 丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對高血糖模型小鼠的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

表6 丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對高血糖模型小鼠的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

注：治療前，與空白組比較，# P ＜0.05；治療后，與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別造模成功后測得血糖灌胃30 d 后測得血糖顆粒劑高劑量組19.090±5.29419.189±4.334△△顆粒劑中劑量組20.060±6.20920.530±4.172△顆粒劑低劑量組19.200±4.49520.720±4.734△口服液高劑量組20.090±4.33518.790±3.099△△口服液中劑量組19.540±4.80319.900±4.512△口服液低劑量組19.470±4.96921.200±6.483空白組19.890±5.66025.360±4.595陽性組20.190±5.51117.940±4.885△△正常組 8.560±0.669# 8.330±0.291△△

2.4.2.3 高血糖模型動物糖耐量實驗 各組禁食4 h后立即測量其血糖濃度，測量完畢后立刻向上述各組（顆粒劑高劑量組、中劑量組、低劑量組）給藥或對應體積的溶劑（蒸餾水）。給藥完成20 min 之后，通過腹腔以2.0 g·kg-1為體質量劑量進行葡萄糖注射。注射后分別于0.5 h 和2 h 后測定各組的血糖濃度，并根據計算其葡萄糖曲線下面積（AUC）。實驗后分別將給藥組的0 h、0.5 h、2 h 時刻的血糖濃度以及AUC 值與空白對照組進行對比，觀察其變化。丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對高血糖模型小鼠的糖耐量影響見表7。與空白組相比，不同濃度的丹瓜護脈口服液和丹瓜護脈顆粒劑對小鼠血糖曲線下面積明顯下降，具有顯著性差異。

表7 丹瓜護脈顆粒和丹瓜護脈口服液對高血糖模型小鼠的糖耐量影響（±s，n= 10）

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別0 h 血糖濃度/（mmol·L-1） 0.5 h 血糖濃度/（mmol·L-1） 2 h 血糖濃度/（mmol·L-1） 血糖曲線下面積顆粒劑高劑量組19.19±4.33##34.56±12.3820.82±4.18##59.09±8.52##顆粒劑中劑量組20.53±4.17#39.96±3.9822.52±4.21#62.23±7.31#顆粒劑低劑量組20.72±4.73#41.52±4.9621.70±4.77#62.98±7.54#口服液高劑量組18.79±3.10##37.92±5.58#20.51±4.35##58.00±3.53##口服液中劑量組19.90±4.51#38.13±5.9822.67±4.69#60.11±8.96#口服液低劑量組21.20±6.4840.20±6.0122.83±5.9862.63±9.30#空白組25.36±4.6044.52±7.4526.97±3.0271.84±8.55陽性組17.94±4.89##32.76±8.12##14.51±4.14##48.13±10.91##

由表4 和表7 可知，與空白對照組比較，顆粒劑組和傳統口服液劑組均可顯著降低小鼠的血糖值，表明該方藥效良好；顆粒劑組藥效與傳統口服液劑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，丹瓜護脈口服液改變原劑型制成顆粒劑方案科學、合理、可行。

3 討論

在流動相的選擇中，本實驗先用甲醇和0.1%磷酸溶液作為液相流動相，發覺丹酚酸B 的分離不理想，然后加入甲醇，峰形發生變化，便把甲醇改為乙腈，發現芍藥苷和丹酚酸B 在圖上峰型較好，故對乙腈和0.1%磷酸溶液的流動相濃度進行調節，乙腈-0.1% 磷酸為17:83 峰型較好，分離度較好，因此本實驗選擇了17:83 的乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

持續的高血糖模型實驗的造模常常采用鏈脲佐菌素進行造模[9-10]，這是一種廣譜抗生素，但由于其對胰島β 細胞具有高度的選擇性且對胰島β 細胞具有一定毒性，故導致機體出現糖尿病癥狀，其病理機制為使胰島β 細胞壞死，使機體出現胰島素依賴性糖尿病；腎上腺素是一種交感神經興奮藥物，可以促進多條糖代謝途徑以迅速提高機體血液的含糖量，使得血糖迅速升高。利用這一特點可向小鼠注射腎上腺素以形成急性高血糖模型。

本實驗結果顯示，對比丹瓜護脈制劑劑型在對抗由腎上腺素所引起的急性高血糖實驗中，口服液組降血糖的作用強度較強，與空白組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01），與陽性組對比，均存在顯著差異（P＜0.05）。提示低劑量的丹瓜護脈顆粒及其口服液對急性高血糖的對抗具有顯著功效。

與空白組相比，使用任意一種丹瓜護脈制劑向小鼠灌胃，均可顯著降低其葡萄糖的曲線下面積（P＜0.05），其中高劑量口服液組與高劑量顆粒組（P＜0.01），提高機體的糖耐量。但其效果遠不及陽性組的二甲雙胍效果（P＜0.05），其中顆粒劑組不同劑量間曲線下面積差異不顯著（P＞0.05），結合上述實驗臨床使用建議使用低劑量即可，避免長時間服用導致攝入糖分較高。

綜上所述，對于長期高血糖，丹瓜護脈制劑具有預防高血糖加重作用，但不如二甲雙胍的降血糖功效顯著，且其顆粒劑本身或存在一定含糖量；對于急性高血糖患者，其具備一定降糖功效。