丁香酚對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌梗死保護作用

黃瀟瀟 黃連軍

心肌梗死是由冠狀動脈缺血而引起的心肌壞死，其急性期具有很高的死亡風險，而慢性期則以心室重構和心力衰竭為特征。研究表明，心肌缺血缺氧后會導致氧化應激反應過度激活，而受損心肌的氧化應激會進一步誘導心肌細胞凋亡，加重心臟功能障礙[1]。心肌細胞凋亡在整個心臟重塑過程中持續存在，并顯著影響抗心肌缺血治療療效[2]。因此，抑制心肌細胞凋亡對于減輕心臟功能障礙具有重要意義，是修復受損心臟和治療缺血性心臟病的關鍵[1]。丁香酚是丁香的主要活性成分之一，具有抗炎、抗纖維化、抗凋亡、抗氧化和抗癌等多種藥理作用[3]。此外，丁香酚包合物可通過抑制核因子κB 信號通路的活化起到抗心肌缺血再灌注損傷的作用[4]。而丁香酚對急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的保護作用及其機制仍然未知。本研究探討了丁香酚對異丙腎上腺素（ISO）誘導的AMI 模型大鼠的潛在保護作用及其可能作用機制，旨在為治療AMI 提供思路。

1 實驗材料

1.1動 物 40 只健康SPF 級雄性Wistar 大鼠（250～280 g）購自杭州子源實驗動物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0004。由浙江海康生物飼養，實驗飼養室許可證號：SYXK（浙）2021-0005。飼養條件：溫度（22±2）℃，12 h 光暗環境交替，大鼠自由進食飲水，實驗開始前適應性飼養1 周。動物實驗方案經溫州醫科大學倫理委員會審批（倫理批號：wydw2023-0094）。

1.2主要藥物、試劑和儀器 丁香酚（純度≥98%，批號246719）和ISO（批號1351005）購自美國Sigma公司；肌酸激酶（CK，批號210116）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批號210415）、乳酸脫氫酶（LDH，批號210117）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT，批號210716）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號210125）、白介素-6（IL-6，批號210307）、丙二醛（MDA，批號210107）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號201202）、Annexin VFITC 細胞凋亡檢測試劑盒（批號C1062）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）試劑（批號D025-1）購自南京建成生物工程研究所。RIPA 裂解液（批號89901）、BCA 蛋白定量分析試劑盒（批號23227）、增強型化學發光（ECL）試劑盒（批號32106）購自美國Thermo Fisher Scientific 公 司。iNOS（批 號ab178945）、Cleaved Caspase 3（批號ab2302）和β-actin 抗體（批號ab8226）及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號ab150077）購自美國Abcam 公司。多導生物記錄儀（型號：BL-420F）購自成都泰盟科技有限公司、離心機（型號：HC-2518R）購自安徽中科中佳科學儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1AMI 模型的建立與分組 40 只大鼠按隨機數字表法分為五組：對照組、模型組、丁香酚低劑量組（1 mg/kg）、丁香酚中劑量組（10 mg/kg）和丁香酚高劑量組（100 mg/kg），每組8 只。丁香酚各劑量組予以相應劑量丁香酚灌胃，對照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃，每日1 次，連續7 d。除對照組外，各組大鼠皮下注射100 mg/kg ISO，連續2 d，建立AMI 模型，以心電圖ST 段抬高（即高于0.2 mV）為造模成功判斷指標[5]，對照組注射等量生理鹽水。

2.2心肌損傷指標測定 末次給藥后，40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，切開腹腔，從下腔靜脈采集血液標本，4 ℃下2500 r/min 離心10 min 后收集上清液，采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）根據相應試劑盒說明測定血清CK、CK-MB、LDH 和cTnT 水平。

2.3氧化應激和炎癥因子指標測定 取部分心肌組織、稱重、加入0.5 mL 磷酸鹽緩沖液，研磨后得到勻漿液，以2500 r/min 離心，收集上清液。使用ELISA法測定心肌組織中MDA、SOD、TNF-α 和IL-6 含量。

2.4梗死面積測定 TTC 染色用于評估心肌梗死面積[6]。大鼠安樂死后，取心臟置于-20 ℃冰箱中20 min，稱重，切片（2～3 mm），在1% TTC 溶液中于37 ℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定24 h。梗死區為白色，正常為紅色，Image J 軟件用于分析梗死面積，心肌梗死率（%）=梗死區面積/總面積×100%。

2.5心肌細胞凋亡測定 各組取部分心肌組織，眼科剪剪成糜狀，PBS 沖洗，加入1 mL 胰酶消化液，用移液器間斷吹打消化組織，最后用1 mL 預冷PBS 沖洗終止消化，過濾，離心5 min 收集各組心肌細胞。按照凋亡檢測試劑盒說明書，每組細胞用結合緩沖液重懸后，將細胞與5 μL Annexin-V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（PI）染色劑避光孵育15 min。最后，使用FACS Calibur 流式細胞儀（Becton Dickinson）分析凋亡細胞。初次進行流式細胞儀檢測時設置未染色、PI 單染和Annexin V-FITC 單染這3 個對照。

2.6Western blot 將心肌組織在冰上用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解并勻漿。然后，將勻漿液在4 ℃下5000 r/min 離心15 min，取上清液，通過BCA 蛋白定量分析試劑盒測量蛋白濃度。將30 μg蛋白樣品在10% SDS-PAGE 上進行電泳，隨后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉，加入一抗iNOS（稀釋1∶1000）、Cleaved Caspase 3（稀釋1∶500）和β-actin（稀釋1∶1000）于4 ℃下孵育過夜，洗滌后，加入二抗于37 ℃下孵育1 h，用ECL 法進行化學發光。用Image J 軟件對蛋白表達進行定量，β-actin 作為內參。實驗重復3 次測量。

2.7統計學方法 應用SPSS 20.0 統計軟件處理數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1各組大鼠血清心肌損傷指標含量比較 與對照組比較，模型組大鼠血清CK、CK-MB、LDH 和cTnT水平顯著升高（P＜0.01），而中、高劑量的丁香酚可顯著降低AMI 模型大鼠血清CK、CK-MB、LDH 和cTnT水平（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標含量比較（）

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標含量比較（）

注：對照組為健康Wistar 大鼠，予生理鹽水；模型組為AMI 模型大鼠，予生理鹽水；丁香酚低劑量組為AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中劑量組為AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高劑量組為AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 為急性心肌梗死；CK 為肌酸激酶；CK-MB 為肌酸激酶同工酶；LDH 為乳酸脫氫酶；cTnT 為心肌肌鈣蛋白T；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.2各組大鼠心肌組織梗死面積比較 與對照組比較，模型組梗死面積顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，丁香酚各劑量組大鼠梗死面積顯著減少（P＜0.01）。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織梗死情況比較（2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色）

表2 各組大鼠心肌組織梗死面積及iNOS 蛋白表達比較（）

表2 各組大鼠心肌組織梗死面積及iNOS 蛋白表達比較（）

注：對照組為健康Wistar 大鼠，予生理鹽水；模型組為AMI 模型大鼠，予生理鹽水；丁香酚低劑量組為AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中劑量組為AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高劑量組為AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 為急性心肌梗死；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.3各組大鼠心肌組織iNOS 蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠iNOS 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，丁香酚各劑量組iNOS 表達顯著降低（P＜0.01）。見表2、圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織iNOS 蛋白表達比較

3.4各組大鼠炎癥因子含量比較 與對照組比較，模型組TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，中、高劑量丁香酚組可顯著降低TNF-α和IL-6 水平（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠炎癥因子和氧化應激指標含量比較（）

表3 各組大鼠炎癥因子和氧化應激指標含量比較（）

注：對照組為健康Wistar 大鼠，予生理鹽水；模型組為AMI 模型大鼠，予生理鹽水；丁香酚低劑量組為AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中劑量組為AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高劑量組為AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 為急性心肌梗死；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；SOD 為超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.5各組大鼠氧化應激指標含量比較 與對照組比較，模型組MDA 水平升高，SOD 水平下降（P＜0.01）。與模型組比較，中、高劑量丁香酚可顯著降低AMI 大鼠MDA 水平，上調SOD 水平（P＜0.01）。見表3。

3.6各組大鼠細胞凋亡水平比較 與對照組比較，模型組心肌細胞凋亡水平和Cleaved Caspase 3 表達水平顯著升高（P＜0.01），而中、高劑量丁香酚能顯著降低細胞凋亡和Cleaved Caspase 3 水平（P＜0.01）。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠細胞凋亡水平比較

表4 各組大鼠細胞凋亡水平比較（）

表4 各組大鼠細胞凋亡水平比較（）

注：對照組為健康Wistar 大鼠，予生理鹽水；模型組為AMI 模型大鼠，予生理鹽水；丁香酚低劑量組為AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中劑量組為AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高劑量組為AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 為急性心肌梗死；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

4 討論

丁香酚具有抗氧化和心臟保護活性，在臨床治療心血管疾病方面具有較大的開發價值[3]。ISO 是一種非選擇性β 腎上腺素受體激動劑，可引起心臟過度刺激，導致缺血、嚴重氧化應激和炎癥反應，從而導致AMI。本研究顯示給予大鼠ISO 與心肌損傷有關，主要表現為AMI 診斷標志酶CK、CK-MB、LDH和cTnT 水平增加，此外，模型組心肌組織顯示大面積梗死區，而丁香酚能顯著改善大鼠梗死面積并降低AMI 診斷標志酶水平，提示丁香酚可能是臨床應用中潛在的AMI 治療藥物。有研究表明，丁香酚可通過調節LDH、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、MDA和CK 來緩解心肌缺血再灌注損傷[4]，與本研究結果一致。

ISO 誘導的心肌損傷機制是多方面的，本研究通過氧化應激、炎癥和心肌細胞凋亡等方面來研究其可能機制，并闡明丁香酚的可能保護機制。據報道，給予大劑量的ISO 可增加MDA 并降低SOD 水平，導致嚴重的氧化應激，并引起大鼠心肌壞死性損傷[7]。與之前研究一致，我們的數據顯示在ISO 給藥后顯著增加MDA 水平并降低SOD 水平，而丁香酚在預防氧化應激引起的心肌損傷中有積極作用，這可能是其具有心臟保護作用的原因。先前的研究也表明，丁香酚具有很強的抗氧化和抑制脂質過氧化作用[4]。同時，受損心肌的氧化應激會進一步誘導心肌細胞凋亡[1]。在本研究中，丁香酚可改善AMI 模型大鼠中的細胞凋亡，說明丁香酚的抗氧化和抗凋亡作用對AMI 具有保護作用。

本研究中，促炎癥細胞因子TNF-α 和IL-6 的表達增強提示ISO 誘導的心臟組織中炎癥狀態加重，而丁香酚處理減少了促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6 表達，與王娜等[4]結果一致。Ma等[8]研究表明，丁香酚能抑制脊髓損傷大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平，促進其功能恢復。此外，一氧化氮（NO）在心血管疾病的治療中起著重要作用[9]。在AMI 中，各種心臟細胞中iNOS 的過度誘導，導致介導氧化應激、炎癥活動和心肌損傷發展的NO 過度產生[10]，表現為作為氧化應激指標的MDA 顯著增加及作為炎癥介質的IL-6 和TNF-α 顯著增加。本研究中，丁香酚處理可以中和iNOS 的異常誘導，降低組織iNOS蛋白表達水平，與前期研究報告類似[10-11]。

綜上所述，丁香酚對ISO 引起的AMI 具有改善作用，其機制可能與調節iNOS、炎癥和氧化應激有關。