ncRNAs介導的MPP7上調與ccRCC的相關性研究

章俞昕 程輝 陳衛建 陳濱海

腎癌是腎臟的惡性腫瘤，以起源于腎實質泌尿小管上皮的腎細胞癌為主，其中約70%為腎透明細胞癌（ccRCC）［1］。由于其早期癥狀的隱匿性，多數患者最初診斷時已發生遠處轉移失去了手術機會，預后較差［2］。隨著基因組學的發展，新靶點和信號通路的挖掘將為ccRCC 的預測、治療和改善預后帶來新選擇。本文旨在分析棕櫚?；鞍?（MPP7）在ccRCC 中的表達及其與臨床病理特征的關系，判斷其診斷價值并分析其對預后的獨立預測價值，預測與分析MPP7 作用機制。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數據下載、處理、分析 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載泛癌項目數據并進行標準化處理。使用R 包limma、ggplot2 對MPP7 進行差異表達分析和可視化處理。

1.2 GEPIA 數據庫分析 基因表達譜交互分析（GEPIA）用于分析MPP7 mRNA 和相關lncRNA 的差異表達，確定不同類型的癌癥中MPP7 和相關lncRNA 的表達，進行生存分析，評估候選lncRNA 在ccRCC 中的預后價值。此外，還使用GEPIA 評估了MPP7 與ccRCC中免疫檢查點的表達相關性。

1.3 starBase 數據庫預測和分析 MPP7 的上游結合miRNA 由starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預測。僅采用出現在≥3 個程序中的預測miRNA 用于后續分析。這些預測的miRNA 被認為是MPP7 的候選miRNA。通過starBase 對ccRCC 中的miRNA-MPP7、lncRNAMPP7 和lncRNA-miRNA 進行表達相關分析，并預測可能與關鍵miRNA 結合的候選lncRNA。

1.4 OncomiR 數據庫分 析 OncomiR（http：//www.oncomir.org/）是一個探索miRNAs 相關研究的數據庫。使用OncomiR 評估候選miRNA 的預后價值。

1.5 統計學分析 使用R3.6.3 軟件進行統計分析，通過多重假設檢驗（Dunn’s test）評估各臨床分期的MPP7表達差異。使用R 包pROC 進行ROC 分析。使用R 包Survival 進行單、多因素回歸分析。

2 結果

2.1 MPP7 表達的泛癌分析 為了探討MPP7 在腫瘤發生中的可能作用，首先分析MPP7 在18 種腫瘤中的表達情況。如圖1A 所示，與正常標本相比，在13 種腫瘤中MPP7 均明顯下調（P＜0.05），3 種腫瘤中明顯上調（P＜0.05），在ESCA、LUAD 中無明顯差異（P＞0.05）。接下來，利用GEPIA 數據庫進一步驗證了MPP7 在泛癌中的表達。如圖1（B-N），MPP7 在7 種腫瘤中表達下調（P＜0.05），在6 種腫瘤中上調（P＜0.05）。綜上所述，MPP7 可能在9 種癌癥的癌變過程中起著重要的調節作用。

圖1 MPP7在泛癌中的表達分析（*P＜0.05，**P＜0.01,***P＜0.001）

2.2 MPP7 在癌癥中的預后價值 進行MPP7 在腫瘤中的生存分析（見圖2），包括總生存率（OS）和無病生存率（RFS）。關于OS，MPP7 高表達在KIRC、KIRP中對預后有利，而在BLCA、LIHC 中影響預后。關于RFS，只有在ccRCC 中，MPP7 高表達提示預后良好。結合以上，高表達的MPP7 可作為ccRCC 患者較良好預后的生物標志物。

圖2 基于GEPIA數據庫對多種癌癥與MPP7的預后分析

2.3 MPP7 的表達與ccRCC 的臨床分期相關性分析 分析發現MPP7 的表達量在各臨床分期對比正常組織均有下調。進一步分析各臨床分期之間MPP7 的表達量差異（圖3），T3/T4 分級組患者的MPP7 表達量低于T1/T2 分級組，高組織學期和高病理學分期患者的MPP7表達量低于低分期患者，遠處轉移陽性患者MPP7表達低于陰性患者。

圖3 ccRCC中MPP7表達與臨床特征的關系。A.組織學分級；B.M分期；C.病理分期；D.T分期；E.ccRCC隊列MPP7表達的ROC曲線

2.4 MPP7 表達對ccRCC 的診斷價值 通過ROC 曲線評估MPP7 表達的診斷價值（圖3E），MPP7 的曲線下面積（AUC）為0.974（95%CI：0.954-0.994），具有良好的診斷價值。

2.5 MPP7 高表達是ccRCC 預后良好的獨立預后因素 單因素分析顯示，腫瘤狀態（HR=3.228，P＜0.001）、遠處轉移（HR=4.389，P＜0.001）、淋巴結狀態（HR=3.453，P＜0.001）、病理分期（HR=3.946，P＜0.001）、年齡（HR=1.765，P＜0.001）、組織學分期（HR=2.702，P＜0.001）、MPP7 表達（HR=0.367，P＜0.001）與總生存率顯著相關。多因素分析提示，遠處轉移陰性、年齡小、MPP7 表達上調是ccRCC 預后良好的獨立預后因素。

2.6 MPP7 上游miRNA 的預測與分析 ncRNAs 在基因表達調控中起著重要的作用。為了確定MPP7 是否被一些ncRNA 所調控，利用Starbase 數據庫預測了43 個可能與MPP7 結合的上游miRNAs，并利用Cytoscape3.9.0軟件建立了miRNA-MPP7 調控網絡。根據miRNA 在調控靶基因表達中的作用機制，miRNA 與MPP7 之間可能存在負相關性。進行表達相關分析顯示MPP7 與包括hsa-miR-130a-3p 在內的20 個miRNA 呈顯著負相關，與包括hsa-miR-532-5p 在內的6 個miRNA 呈顯著正相關，與其他17 個預測的miRNAs 之間差異無統計學意義（P＞0.05）。最后，通過OncomiR 預測與MPP7 呈負相關的miRNA 在ccRCC 中的預后價值。最終發現包括hsa-miR-130a-3p 在內的8 個miRNA，其上調與患者預后呈負相關，可能是MPP7 在ccRCC 中最有潛力的調控miRNA。

2.7 關鍵miRNA 上游lncRNA 的預測和分析 利用starBase 數據庫對hsa-miR-130a-3p 等8 個miRNA的上游lncRNA 進行了預測，共得到了347 個可能的lncRNAs，并構建了調控網絡。通過GEPIA 網站檢測這些lncRNAs 在ccRCC 中的表達水平。在所有的347 個lncRNAs 中，只有HAGLR 等7 個lncRNAs 與正常對照組相比有明顯下調。在此基礎上，對這7 個lncRNAs 在ccRCC 中的預后價值進行了評估。只有HAGLR、FGD5-AS1 表達較高的ccRCC 患者OS、RFS 均較好。根據競爭性內源性RNA 假說，lncRNA 可以通過與共享miRNA的競爭結合來增加mRNA 的表達［3］。因此，lncRNA與miRNA 之間應存在負相關或與mRNA 之間存在正相關。結合表達分析、生存分析和相關性分析，HAGLR和FGD5-AS1 可能是ccRCC 中hsa-miR-19b-3p/MPP7軸最有潛力的兩個上游lncRNA。

3 討論

本研究中，作者首先對MPP7 在泛癌中的表達進行分析，隨后進行了生存分析，結果顯示高表達MPP7 的ccRCC 患者預后較好。進一步研究發現MPP7 的表達量在ccRCC 不同臨床分期中對比正常組織均有下調，除此之外較晚分期中的表達量對比較早分期也有下調。多因素分析顯示MPP7 表達上調是ccRCC 預后良好的獨立預后因素，提示MPP7 可能是一種潛在的抑癌基因。

有研究顯示ncRNAs 通過ceRNA 機制參與了基因表達的調控。由此作者預測了MPP7 的上游調控miRNA，共得到了43 個miRNA。其中與MPP7 呈負相關性的miRNA 通常發揮著促進腫瘤發生的作用，例如hsa-miR-130a-3p 被認為是乳腺癌進展過程中關鍵的調控分子［5］；hsa-miR-130b-3p 能抑制前列腺癌的抑癌基因而參與其發病［6］；miR-454-3p 靶向TRIM3，抑制其表達以促進宮頸癌的進展［7］；hsa-miR-27a-3p 通過對PROS1mRNA 表達的抑制，對抗其發揮的抑制膽管細胞癌的作用［8］；hsa-miR-223-3p 在ccRCC 中表達上調，參與ccRCC 的啟動和發展等［9-10］。經過表達和預后分析，篩選出包括hsa-miR-130a-3p 在內的8 個miRNA，其可能是MPP7 在ccRCC 中最有潛力的調控miRNA。

根據競爭性內源性RNA 假說，miRNA/MPP7 軸的潛在lncRNAs 可能是在ccRCC 中調控MPP7 表達的重要lncRNA［11］。作者利用starBase 數據庫預測得到了347 個lncRNA，同樣通過表達和生存預后相關分析，確定了兩種最有潛力的上調型lncRNA，包括HAGLR和FGD5-AS1。有報道這兩種基因在包括ccRCC 在內的一些惡性腫瘤中起抑癌基因的作用，例如HAGLR 能通過靶向miR-26b-5p抑制卵巢癌細胞增殖和促進細胞凋亡［12］，或通過表觀基因沉默E2F1 來抑制肺腺癌生長［13］；FGD5-AS1 高表達的ccRCC 的生存期高于低表達組，也有小樣本研究證實FGD5-AS1 能抑制胃癌上皮向間充質轉化以抑制腫瘤生長［14］。

總之，MPP7 在包括ccRCC 在內的多種腫瘤中低表達，且MPP7 表達增加與ccRCC 預后良好有關，作為一種抑癌基因可以成為ccRCC 的獨立預后標志物。其次，作者確定了MPP7 在ccRCC 中的上游調控機制，即HAGLR/FGD5-AS1-hsa-miR-19b-3p 軸。但本研究仍有局限性，需要大量臨床實踐加以驗證。