結直腸癌中MMR蛋白表達意義的驗證與研究

陳國群 嵇學仙 沈苗 毛建英 李斐

結直腸癌的發病率和病死率已排在全球惡性腫瘤的前3 位，并逐年增高［1］。隨著基因分子生物學的深入研究，發現由錯配修復（MMR）蛋白功能缺陷引起的微衛星不穩定性（MSI）與結直腸癌的發生和發展機制相關［2］。近年來，由MSI 引起了較多臨床工作者的關注。由MMR 蛋白功能缺陷引起的高度MSI（MSI-H）在結直腸癌的指導治療中作用明顯，對其預后的評估也有重要意義［3-4］。經相關文獻檢測，所有結直腸癌病例中，有3%～5%的病例與遺傳性結直腸癌綜合征相關，其中以Lynch 綜合征最為常見［5］，Lynch 綜合征是一種遺傳性家族性疾病，大部分患者會發生結直腸癌，患者及其家族中MMR 基因突變攜帶者，均有發生腸外多組織癌變的傾向。定期結腸鏡檢查，對于Lynch 綜合征的家族遺傳傾向患者，可以早期診斷腫瘤并及時進行干預治療［6］。本研究旨在分析MMR 蛋白免疫組化（IHC）檢測與MSI 分子檢測的一致性，以及與臨床多方面的相關性，并作為Lynch 綜合征的一種常規篩查手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年3 月至2022 年6 月本院病理科結直腸癌根治術后經病理學確診，腫瘤為原發性且術前未經新輔助治療的232 例患者，其中男133 例，女99 例；年齡42～85 歲，平均年齡65 歲。

1.2 方法 對結直腸癌腫塊標本進行MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2）IHC 檢測，缺失表達者進行分子檢測。本研究經由本院倫理委員會及技術委員會審核通過（2020.10）。（1）IHC：結直腸癌根治及活檢標本離體后，先經10%甲醛液固定≥6 h，后脫水機梯度酒精脫水，石蠟包埋，進行連續切片（切片厚3～4μm），行常規HE 及IHC EnVision 法染色。一抗采用兔抗人單克隆抗體PMS2、MSH6，鼠抗人單克隆抗體MLH1 和MSH2，抗體向北京中杉金橋生物技術有限公司購買，按產品說明步驟進行染色。最后由本科兩名主任醫師進行IHC 切片的復讀。IHC 判讀標準：觀察正常腸腺上皮細胞及周圍淋巴細胞等內對照細胞，以細胞核棕黃/黃色為正常著色的前提下，腫瘤細胞陽性表達（+）為核著棕黃/黃色，陰性表達（-）為腫瘤細胞核未著色；MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 均呈陽性為MMR 正常蛋白表達（PMMR，圖1-2），任意一種蛋白表達缺失則判讀為MMR 蛋白缺失（DMMR）［7］（圖3-4）。（2）分子檢測：MSI 檢測由迪安公司（杭州）采用MSI檢測試劑盒進行，采用熒光PCR 擴增結合毛細管電泳法，檢測NR-21、NR24、BAT-25、BAT-26、MONO-27 五個位點。具體方法：由科內2 名病理診斷主治醫師經光鏡下觀察常規HE 切片選取樣本，腫瘤樣本為腫瘤成分≥20%的腫瘤石蠟包埋組織和對照樣本為石蠟包埋癌旁正常組織；樣本經DNA 提取、PCR 擴增、毛細管電泳分離后，分析判定微衛星檢測結果。結果判定根據不穩定單核苷酸重復位點個數，由兩名分子病理醫師進行判讀，≥2 個位點判斷為MSI-H，≤1 個位點判斷為微衛星低度不穩定或微衛星穩定（MSI-L/MSS）。

圖1 腸癌（MSH2×100）

圖2 腸癌（MSH6×100）

圖3 腸癌（MLH1×100）

圖4 腸癌（PMS2×100）

1.3 統計分析 采用SPSS19.0 統計軟件。計數資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MMR 蛋白及MSI 表達情況 MMR 蛋白表達情況：232 例結直腸癌病例中，＞99%的病例MMR 表達良好（細胞核均勻染色），個別病例細胞核弱染色，但均有內對照（淋巴細胞等間質細胞著色）。MMR 總缺失例數為12 例，表達缺失率為5.17%，具體情況如下：MLH1（12 例，5.17%）、MSH2（0 例）、MSH6（0 例）、PMS2（12 例，5.17%），MLH1 和PMS2 均為共同表達。文獻報道4.3%～20.0%的結直腸癌為DMMR［8-13］，冰島的一項長達九年對1,182 例結直腸癌標本進行MMRIHC 篩查，發現DMMR 者共132 例，占腸癌的11.2%［14］；來自亞洲人群的一項日本人研究顯示1,234例結直腸癌病例中，有61 例（4.9%）DMMR 患者［15］。鑒于人種、地域、飲食、氣候的差異，理論上我們應該與日本的研究數據相符，實際上也的確如此。DMMR 病例進行MSI 分子檢測均提示MSI-H，符合率100%。文獻報道DMMR與高度MSI 一致率＞90%［16-17］，與文獻報道相符。

2.2 DMMR 病例的臨床資料與分析 單因素分析，DMMR 病例與結直腸癌患者的腫瘤大小、腫瘤分化程度以及UICC 分期具有明顯相關性，見表1。

表1 232例結直腸癌患者MMR表達與臨床病理的關系（n）

2.3 DMMR 病例的臨床追蹤 結合阿姆斯特丹Ⅱ標準、修訂版的貝塞斯達標準，12 例DMMR 患者中，有1 例高度懷疑為林奇綜合征病例，但因經濟等多方面原因，患者未做林奇綜合征的基因檢測。隨訪過程中，該例患者復查腸鏡，提示左半結腸癌，其兄妹及母親行腸鏡檢查，也均檢及管狀腺瘤。故可將該患者列為“林奇綜合征樣”病例，對其家族進行隨訪。余11 例DMMR患者中，有4 例患者在術后兩年隨訪中，腸鏡檢出管狀腺瘤，3 例CT 檢出肺部磨玻璃結節，1 例子宮肌瘤，1例前列腺癌。

3 討論

微衛星作為一種在復制過程中長度一般保持不變的具有端重復單元的DNA，容易在復制過程中出現錯配。MSI 的發生即DNA 復制過程中產生錯配DNA，MMR蛋白無法對其準確識別并修復［18-19］進而導致的結果。DMMR 更常見于低分化癌、腫瘤體積較大以及UICC 分期Ⅰ～Ⅱ期患者。目前，臨床診療中發現，檢測腫瘤MSI 對結直腸癌的診療和判斷預后有重要意義，大部分學者認為，MSI-H 提示結直腸癌患者預后良好［20］。另外，大多數研究結果顯示，結直腸癌患者MSI 可作為5-FU 輔助治療無效的預測標志物［21］。

林奇綜合征是一種由于DNA MMR 基因發生胚系突變所致的常染色體顯性遺傳病。突變基因攜帶者本人及家族成員最常多發結直腸癌，在所有結直腸癌的所占比例約3%～5%，還會發生腸外其他多種相關腫瘤，包括女性發生子宮內膜癌、卵巢癌，泌尿系腫瘤如膀胱癌、腎癌，消化道腫瘤如胃癌、小腸癌等。攜帶者有較高風險終生患結直腸癌和子宮內膜癌，而且普遍在年紀較輕時發病，平均診斷年齡分別約為45 歲和46 歲，而普通人群多為中老年發病。早期發現診斷林奇綜合征可以通過及時治療降低結直腸癌患者死亡率并預防結直腸癌的發生，降低其發病率。

因此有效的篩查手段至關重要，參考美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）推薦使用MSI 或IHC 對所有結直腸癌患者進行林奇綜合征篩查。綜合考慮操作簡便、價格實惠等因素，病理科會選用IHC 法檢測MMR 蛋白，篩查腫瘤MSI 狀態。經驗證，本研究DMMR 與高度MSI一致率達到100%。故MMR 蛋白IHC 檢測可作為MSI分子檢測的完美替代品，可以減輕患者的經濟負擔，并結合臨床資料以及結合阿姆斯特丹Ⅱ標準、修訂版的貝塞斯達標準，可作為林奇綜合征的篩查手段。

最新研究顯示：已被用于多種惡性腫瘤治療的程序性細胞死亡受體1（PD-1）抗體，對普通人群結直腸癌患者治療效果不明顯，因結直腸癌被視為免疫“冷”腫瘤，故而對抗PD-1 治療不敏感。DMMR/MSI-H 的分子特征是篩選免疫檢查點抑制劑（ICIs）治療患者的重要分子標志物［22］。PD-1 免疫檢查點藥物對MSI-H 的CRC 表現出高緩解率，并且在其他MSI-H 晚期腫瘤也對PD-1 治療有較好的療效，包括子宮內膜癌、胃癌、膽管癌和小腸癌。2017 年NCCN 臨床實踐指南更新，推薦PD-1 免疫檢查點藥物用于具有MSI-H 或dMMR 分子表型的mCRC 的治療。因此MSI 可以作為PD-1 免疫檢查點藥物有效性的生物標志物。