兩種免疫性卵巢早衰大鼠模型的構(gòu)建與比較

阮菲 沈煒 周衛(wèi)民

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40 歲之前出現(xiàn)的卵巢儲備功能衰竭的一類疾病，表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕甚至伴有圍絕經(jīng)期癥狀，醫(yī)學(xué)檢測一般為促卵泡生成素（FSH）升高、雌激素（E2）指標(biāo)下降等情況［1-2］，近年來，卵巢早衰的發(fā)病率成逐年上升和低齡化趨勢。卵巢早衰的發(fā)病因素復(fù)雜，發(fā)病機制也不明確，已知的與遺傳、免疫、環(huán)境和不良生活方式、酶缺乏等因素相關(guān)，臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放化療、免疫制劑治療等因素導(dǎo)致的免疫性卵巢早衰占卵巢早衰發(fā)病率的10%～30%［3-4］，該類患者早期不易診斷，后續(xù)治療比較困難。作者在長期研究過程中發(fā)現(xiàn)［5-10］，順鉑腹腔注射和雷公藤多苷口服灌胃制作的模型成模率高，而且模型較穩(wěn)定，因此本文擬對這兩種因素構(gòu)建的大鼠免疫性卵巢早衰模型進行比較研究，并初步探討其發(fā)病機制，為治療免疫性卵巢藥物的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實驗動物：雌性SD 大鼠50 只，6～8周齡，體重180～220 g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2018-0006］。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心［SYXK（浙）2018-0012］，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度50%～69%，光照：12 h/12 h 明暗交替，噪聲＜50 dB；在獨立通氣籠具（IVC）內(nèi)自由進食。所有實驗步驟均按照中國關(guān)于實驗動物使用和護理的立法進行，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心動物福利與倫理審查委員會批準(zhǔn)（20190826-01）。（2）實驗試劑：順鉑（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，601191202），雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥股份有限公司，2005108B），烏拉坦（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，20130609），蘇木色精（上海伯奧生物科技有限公司，180701），曙紅Y（國藥集團話要試劑有限公司，20171112），補加樂（拜爾醫(yī)藥，20210119），F(xiàn)SH、促黃體生成素（LH）和E2試劑盒（南京建成）。（3）實驗儀器：ASP200S 封閉式組織脫水機（Microm，德國）；包埋機（Microm，德國）；半自動石蠟切片機（Microm，德國）；自動染色劑（Microm，德國）；數(shù)字病理切片（熒光）掃描分析儀（VS120-S6-W，Olympus，日本）；Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR，Odyssey CLx），垂直電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD，mini-PROTEAN），蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國BIO-RAD，PowerPac）。

1.2 方法（1）動物分組及實驗干預(yù)：SD 大鼠分為5組：正常組（n=16，8 只作為順鉑對照，8 只作為雷公藤多苷對照），雷公藤多苷模型組（7.5 mg/kg，灌胃，n=8），雷公藤多苷模型治療組（雷公藤多苷7.5 mg/kg，補佳樂0.15 mg/kg，灌胃，n=8），順鉑模型組（順鉑2 mg/kg，腹腔注射，n=8），順鉑模型治療組（順鉑2 mg/kg，腹腔注射，補佳樂0.15 mg/kg，灌胃，n=8）。雷公藤多苷灌胃14 d 后，治療組開始灌胃給藥補佳樂21 d；順鉑腹腔注射7 d 后，治療組灌胃補佳樂21 d。（2）大鼠一般情況觀察：每兩天記錄大鼠體重、活動情況、毛色、糞便和死亡等情況。（3）大鼠動情周期觀察：每天早上給藥前記錄陰道圖片，然后行HE 染色，顯微鏡下觀察大鼠動情周期改變。（4）大鼠血清性激素測定：于造模前、造模完成后和給藥結(jié)束后大鼠眼眶后脈絡(luò)叢取血0.5 mL，分離血清，ELISA 法測定大鼠血清中FSH、LH 和E2的濃度。（5）大鼠卵巢組織臟器指數(shù)的測定：末次取血后，安樂處死大鼠，迅速分離大鼠卵巢組織，吸干表面血漬和組織液，稱重。將一側(cè)卵巢凍存于液氮中，一側(cè)卵巢組織用中性甲醛固定。臟器指數(shù)=雙側(cè)卵巢重量（g）/大鼠末次體重（g）×100%。（6）大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察：取一側(cè)卵巢進行常規(guī)HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下行卵巢組織病理學(xué)觀察。將組織蠟塊行免疫組化染色后，高倍鏡下連續(xù)觀察5 個視野，統(tǒng)計陽性細(xì)胞率作為觀察指標(biāo)。（7）大鼠卵巢組織免疫組化染色：取凍存的大鼠卵巢組織，提取蛋白后將蛋白煮沸變性，離心分取上清液，變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)不同抗體孵育后，激光成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，圖片分析用NDO.View2 處理。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 從表1、圖1 及實驗中可見，順鉑模型組和順鉑治療大鼠體重從造模開始下降，后緩慢上升，在尾部和腿部出現(xiàn)斑禿等脫毛現(xiàn)象，毛色暗淡，活動減少；雷公藤多苷模型組和雷公藤多苷模型治療組大鼠體重緩慢增加，活動減少，扎堆。末次稱重后，順鉑模型組和順鉑模型治療組的大鼠體重低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，n=8）；雷公藤多苷模型組和雷公藤多苷模型治療組體重與正常組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，n=8）。結(jié)果顯示，順鉑誘導(dǎo)的免疫性卵巢早衰大鼠模型體重明顯降低。

圖1 各組大鼠體重變化折線圖

表1 各組大鼠體重數(shù)據(jù)［（），n=8］

表1 各組大鼠體重數(shù)據(jù)［（），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.05

2.2 大鼠動情周期變化 正常組大鼠有規(guī)律的動情周期平均為5～7 d；順鉑模型組和雷公藤多苷模型組大鼠動情周期紊亂，無明顯的規(guī)律，常見動情間期和動情前期的缺失；順鉑模型治療組動情周期略有恢復(fù)，但是動情間期時間延長；雷公藤多苷模型治療組動情周期略有恢復(fù)，但是動情前期偶有缺失。結(jié)果表明兩種造模方式都可以引起大鼠動情周期紊亂。

2.3 大鼠血清性激素測定 各組大鼠血清性激素水平見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平［n=8，（）］

表2 各組大鼠血清性激素水平［n=8，（）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與順鉑模型組比較，#P＜0.05；與雷公藤多苷模型組比較，△P＜0.05

2.4 大鼠卵巢臟器指數(shù)的測定 順鉑模型組［（0.037±0.003）g/g］、順鉑模型治療組［（0.047±0.002）g/g］、雷公藤多苷模型組［（0.046±0.002）g/g］和雷公藤多苷模型治療組［（0.054±0.005）g/g］卵巢臟器指數(shù)小于正常組［（0.061±0.005）g/g］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與順鉑模型組比較，順鉑模型治療組、雷公藤多苷模型組和雷公藤多苷模型治療組卵巢臟器指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明兩種造模方法均可使大鼠卵巢指數(shù)降低。

2.5 大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察 從圖2 中可見，正常組大鼠卵巢中各級卵泡數(shù)量較多，可見成熟的卵泡；順鉑模型組大鼠卵巢組織中可見炎癥細(xì)胞浸潤，初級卵泡和閉鎖卵泡較多，未見成熟的卵泡；順鉑模型治療組可見炎癥細(xì)胞浸潤，初級卵泡和閉鎖卵泡較多，偶見閉鎖的次級卵泡，未見成熟的卵泡；雷公藤多苷模型組可見炎癥細(xì)胞浸潤，初級卵泡、次級卵泡和閉鎖卵泡較多，未見成熟的卵泡；雷公藤多苷模型治療組可見炎癥細(xì)胞浸潤減輕，初級卵泡、次級卵泡和閉鎖卵泡較多，可見閉鎖的成熟的卵泡。病理觀察顯示，兩種模型大鼠卵巢組織均有明顯損傷，出現(xiàn)卵巢早衰癥狀。

圖2 各組大鼠卵巢組織HE染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

2.6 大鼠卵巢組織免疫組化染色觀察 各組大鼠卵巢組織免疫組化染色總光密度數(shù)值見表3。各組大鼠卵巢組織磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、PAKT、雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo)（mTOR）免疫組化染色圖見圖3～6。

圖3 各組大鼠卵巢組織PI3K免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

圖4 各組大鼠卵巢組織AKT免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

圖5 各組大鼠卵巢組織pAKT免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

圖6 各組大鼠卵巢組織mTOR免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

表3 各組大鼠卵巢組織免疫組化染色總光密度數(shù)值［n=5，（）］

表3 各組大鼠卵巢組織免疫組化染色總光密度數(shù)值［n=5，（）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與順鉑模型組比較，#P＜0.05；與雷公藤多苷模型組比較，△P＜0.05

3 討論

PI3K 和AKT 信號通路在卵巢組織中細(xì)胞增殖、凋亡和自噬過程最主要的信號通路之一，對卵母細(xì)胞的生長、原始卵泡的發(fā)育以及顆粒細(xì)胞的增殖、分化均起到重要的作用［11-12］。mTOR 是PI3K/AKT 信號通路的下游蛋白，AKT 通過磷酸化的Ser-448 位點激活mTOR，進而調(diào)控卵泡的發(fā)育，有研究表明，mTOR 活化水平下降可導(dǎo)致卵泡發(fā)育遲緩；mTOR 的過度表達(dá)可損傷亂丘細(xì)胞，進而引起胰島素抵抗影響卵泡的正常發(fā)育；卵泡顆粒細(xì)胞中mTORC1 的過度活化加速了POF［11］。因此，PI3K/AKT-mTOR 信號通路在卵巢早衰中是比較敏感的存在。本實驗大鼠卵巢組織的免疫組化染色驗證了順鉑和雷公藤多苷均可以引起PI3K、AKT 的陽性細(xì)胞計數(shù)高于正常組，說明順鉑和雷公藤多苷均可用于制作大鼠卵巢早衰模型。

雷公藤多苷是臨床常用的免疫性疾病治療藥物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用，文獻報道不良反應(yīng)發(fā)生率為58.1%［13］，以生殖系統(tǒng)毒性最為常見，臨床上常見育齡期婦女服用雷公藤導(dǎo)致月經(jīng)紊亂、月經(jīng)量少甚至閉經(jīng)的報導(dǎo)；有文獻研究顯示大鼠灌服雷公藤多苷后引起動情周期紊亂、卵巢指數(shù)下降、雌激素和抑制素B 下降以及卵巢組織各級卵泡數(shù)減少和淋巴細(xì)胞浸潤卵泡的病理改變［14-15］，與本實驗研究的結(jié)果吻合，說明雷公藤多苷灌胃可以制作穩(wěn)定的卵巢早衰模型。

順鉑是臨床常用的化療藥物，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時，對正常細(xì)胞也有不同的損傷作用，由于其對卵巢組織的損傷而被用于卵巢早衰動物模型的制作，有研究表明順鉑可以不同程度的損傷不同發(fā)育時期的卵泡，抑制卵泡顆粒細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制卵巢功能，進一步發(fā)展為排卵減少，導(dǎo)致血清中相應(yīng)的激素水平發(fā)生變化［16］。

通過本次研究發(fā)現(xiàn)，順鉑腹腔注射和雷公藤多苷均可制作穩(wěn)定的卵巢早衰模型，免疫組化染色顯示兩種藥物制作的卵巢早衰模型與大鼠卵巢組織中PI3KAKT-mTOR 信號通路相關(guān)。順鉑對大鼠卵巢的損傷更為嚴(yán)重，不僅模型大鼠出現(xiàn)斑禿、體重降低、卵巢指數(shù)降低外，而且外周血清性激素的恢復(fù)更緩慢，另外，大鼠卵巢組織HE 染色未見成熟的卵泡。雷公藤多苷制作的大鼠卵巢早衰模型較為溫和，對于藥物治療后血清性激素的改變、卵巢病理結(jié)構(gòu)的改變較為明顯，在本次實驗中，更適合于藥物的篩選。