獼猴桃‘臍紅’與‘徐香’越冬期轉錄組的比較分析

毛可欣，王海榮，安 淼，呂 巍，李 健，李國田

（1.山東省果樹研究所，山東泰安 271000；2.山東農業大學生命科學學院，山東泰安 271000）

獼猴桃原產于中國，在中國分布廣泛，全球54個獼猴桃屬種中52 個原產中國，其中44 個為中國特有。中國商業化栽培起步較晚，20 世紀70 年代才開始相關品種普查以及改良工作［1］。當前商業化栽培主要有中華獼猴桃（Actinidia chinensis）、美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）和少量的軟棗獼猴桃（Actinidiaarguta）、毛花獼猴桃（Actinidia erianthaBenth.），其余仍處于野生或半野生狀態。中國已公布選育的獼猴桃品種有百余個，目前有20 多個省份種植，獼猴桃采收面積和產量均位居世界第一［2］。

溫度是影響獼猴桃生長發育的主要因素，低溫脅迫會抑制其生長發育，影響產量，造成巨大損失。獼猴桃在花芽和嫩葉初生時期遭受凍害會出現萎縮、褐變、脫落［3］，在早春遭受低溫脅迫后會落花、無果。冬末春初時枝條、根系易發生凍害，嚴重時導致全株死亡［4，5］。研究表明，不同品種獼猴桃對低溫耐受有較大差異，其中，抗寒力較強的品種有‘魁綠’‘秦美’‘泰山1 號’等，‘徐香’的抗寒力較弱［6］。獼猴桃的低溫脅迫響應機制主要聚焦在ICE-CBECOR依賴的低溫信號通路［7-9］，低溫誘導CBF基因表達，其編碼的蛋白激活COR表達，導致滲透物、低溫保護蛋白等積累，從而使植物提高低溫耐受性。此外，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativaL.）中發現MYB 轉錄因子也可以通過調節CBF的表達來調節植物的低溫耐受性［10］。在低溫脅迫下植物激素也發揮重要作用，油菜素類固醇的信號通路能調節COR的表達［11］，外源施加油菜素類固醇可以增加COR表達以提高植物的耐寒性［12］。茉莉酸信號通路中的JAZ1（Jasmonate ZIM-domain protein）和JAZ4 可以削弱CBF表達［13］，乙烯信號通路中EIN3（Ethylene Insensitive 3）和EIL1（EIN3-Like 1）可以調節CBF的表達［14］。

目前關于獼猴桃不同品種的低溫耐受性尚不明確，黃永紅等［6］的研究中‘徐香’抗寒能力較弱，與山東省泰安市‘徐香’抗寒能力弱結果一致，中華獼猴桃‘臍紅’在泰安市抗寒性表現較好。針對不同品種獼猴桃應對外界低溫的生理變化、低溫響應反應以及調節的相關基因尚不明確，本研究選取抗寒性強的中華獼猴桃‘臍紅’以及抗寒性弱的美味獼猴桃‘徐香’作為研究對象，在秋末（11 月）以及越冬期（12 月、1 月、2 月）取樣，通過轉錄組測序鑒定其差異表達基因，并聚類到相關的途徑，明確其對低溫脅迫的響應差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植株為4 年生‘臍紅’‘徐香’獼猴桃品種，位于山東省果樹研究所泰東科研基地；東經116°20′—117°59′、北緯35°38′—36°28′，年平均降水量697 mm，溫帶半濕潤大陸性季風氣候；中性偏酸沙壤土，有機質含量1%，堿解氮含量19~43 mg/kg，磷含量21~34 mg/kg，鉀含量32~68 mg/kg。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 2020 年11 月15 日至2021 年2 月15日，取直徑為0.5~0.8 cm 1年生的獼猴桃樹新枝作為樣品（‘徐香’‘臍紅’2個品種），每月1次，共取4次，每次3 個重復，用作轉錄組與生理指標的測定材料。

1.2.2 生理指標測定 丙二醛測定使用10%的三氯乙酸（TCA）溶液研磨，取上清液后加入0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴反應，冷卻后離心取上清液，于450、532 和600 nm 波長下測定其吸光值。可溶性糖測定使用蒽酮試劑，測定620 nm 波長下的吸光值。脯氨酸含量測定采用茚三酮法。超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用WST 方法。此外，還測定了電導率的相關數據。

1.2.3 轉錄組測序 參考基因組來自http：//kiwifruitgenome.org/ftp/A_chinensis/Hongyang/v3.0/，使用Hisat2［15］進行比對。使用DEGseq 進行差異表達基因分析，多重檢驗校正方法選擇BH，篩選條件為差異倍數大于2 或者小于0.5，P-adjust 為0.001。組內差異表達分析：分別將12、1、2 月的基因組序列與11月的基因組序列對比，得到組內差異表達基因。組間差異表達分析：將2 個品種各月份的基因組序列進行比對得到差異表達基因。

分別對差異表達基因進行GO 分類統計，選取GO 通路的前20 位（P-adjust＜0.5），繪制氣泡圖；分別對差異表達基因進行KEGG 分類統計，選取KEGG 通路的前20 位（P-adjust＜0.5），去除無關通路，繪制氣泡圖。

1.2.4 差異表達基因的熒光定量PCR 使用EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒提取RNA，使用SUMOnetubeRTMixture 試劑盒反轉錄合成cDNA，qRT-PCR 使用UltraSYBR Mixture（Low ROX）試劑，使用15 μL 體系：cDNA 模板1 μL，2×SYBRGreenMix 7.5 μL，上下游引物（表1）各0.3 μL，ddH2O 5.9 μL，儀器為ABI QuantStudio 6 Flex，結果使用相對定量的2（-ΔΔCT）法處理。

2 結果與分析

2.1 冬季降溫過程中獼猴桃的生理變化

在氣溫較低的11月至次年1月，‘臍紅’與‘徐香’的電導率升高，峰值都出現在氣溫最低的1月（圖1），說明在溫度降低過程中細胞膜有所損傷；二者的丙二醛含量、可溶性糖含量升高，脯氨酸含量先下降后上升。‘臍紅’與‘徐香’的超氧化物歧化酶（SOD）活性差異較大，‘臍紅’的SOD 活性變化幅度較小，‘徐香’的SOD 活性明顯高于‘臍紅’；‘徐香’電導率、丙二醛含量、可溶性糖含量高于‘臍紅’。但在12 月和1 月，‘臍紅’與‘徐香’的可溶性糖含量、脯氨酸含量較接近。結果表明，在氣溫逐漸降低的過程中‘臍紅’的低溫耐受調節高于‘徐香’，且存在除SOD、可溶性糖和脯氨酸外的有效調控途徑。

2.2 獼猴桃種間差異表達分析

‘臍紅’12、1、2 月與11 月相比，差異表達基因數量分別為4 866、5 501 和5 740 個（圖2），數目隨時間推移逐漸增多；上調基因數量分別為3 457、3 450 和2 518 個，下調基因數量分別為1 409、2051 和3 222個，下調基因數量逐漸上升，在12、1 月上調基因數量基本一致，但在2 月上調基因數量減少。‘徐香’12、1、2 月與11 月相比，差異表達基因分別為5 388、4 462 和4 630 個，在12 月差異表達基因數量最多；上調基因分別為2089、2 148 和3 014 個，上調基因數量逐漸增多，下調基因數量分別為3 299、2 314 和1 616 個，數量逐漸減少。

圖2 獼猴桃差異表達基因統計

品種間差異表達基因在GO 分類中包括生殖過程、多細胞生物體過程、發育過程、對刺激的反應、生物調節、代謝過程等（圖3）。在‘臍紅’的GO 聚類中，12 月至次年2 月，細胞成分組織或生物生成、細胞過程、細胞器部分、代謝過程、膜部分等差異表達基因數量有不同程度增加；在2 月，代謝過程和催化活性差異表達聚類增多。而‘徐香’中細胞成分組織或生物生成、細胞器部分等差異表達基因數量沒有明顯增加。從KEGG 通路差異表達基因分布可以看出，‘臍紅’和‘徐香’的基因表達模式具有一定差異，在溫度低于0 ℃的時候‘徐香’出現大量上調表達的基因，而‘臍紅’在整個過程中下調基因較多。12 月至次年1 月‘臍紅’膜運輸、翻譯、轉錄、復制和修復等相關的差異表達基因減少，而在‘徐香’中并沒有明顯減少；2 個品種在其他氨基酸的代謝、輔助因子和維生素的代謝、脂質代謝、氨基酸代謝中差異表達基因均表現為增加，在糖類的生物合成和代謝中均表現為降低。

2.3 獼猴桃在越冬期不同月份差異表達分析

在越冬期GO 注釋統計中（圖4），差異基因富集靠前的GO 通路包括尿酸代謝過程、跨膜運輸、氧化還原酶活性、單氧酶活性、類黃酮代謝等。在氣溫高于0 ℃的11 月，跨膜運輸、磷化作用、單羧酸代謝過程、葡萄糖基轉移酶活性高度富集，隨著越冬期溫度的下降，富集程度降低。溫度下降初期的12 月出現了鐵離子結合相關通路的富集，最冷月1 月出現了轉移酶活性、轉移糖基團和單糖代謝過程的富集，2月出現了運輸、磷的代謝過程、含磷化合物的代謝過程、漿膜的固有成分、血紅素結合相關通路的富集。在溫度下降初期（12 月），尿酸代謝、UDP-葡萄糖基轉移酶活性、次生代謝物的生物合成、氧化還原酶活性、葡萄糖醛酸代謝、類黃酮代謝等過程基因高度富集，其中，氧化還原反應相關的差異表達基因數量激增，11 月的差異表達基因數量為282 個，12 月為323個，但1 月降至34 個。

在越冬期KEGG 通路富集中（圖5），11 月高富集的差異表達基因包含芪類、二芳基庚烷類和姜醇的生物合成、氮素代謝、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝過程等。越冬初期的12 月，出現了玉米素的生物合成、磷脂酰肌醇信號系統、苯丙氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、葉酸的生物合成、精氨酸的生物合成、氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、ABC 運輸工具等相關過程的富集。在氣溫最低的1 月，出現了酪氨酸代謝、蛋白質輸出、其他糖類降解、蕓苔素類化合物生物合成相關的富集。在2 月，出現了色氨酸代謝、檸檬烯和蒎烯的降解、半乳糖代謝、果糖和甘露醇的代謝相關的富集。在整個越冬期都出現了淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導、苯丙類化合物生物合成、黃酮類化合物生物合成等過程的富集。

圖5 越冬期KEGG 富集

2.4 獼猴桃基因表達譜及驗證分析

差異表達基因富集分析發現，淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導、苯丙類化合物的生物合成和黃酮類化合物的生物合成通路始終存在差異表達。由圖6 可知，在基因表達圖譜中2 個品種差異較大，‘徐香’油菜素內酯相關基因表達顯著高于‘臍紅’，推測其在‘徐香’抵御低溫脅迫中發揮作用。其次，在酪氨酸代謝和蛋白質輸出的相關基因中，‘徐香’的表達量高于‘臍紅’。但是在糖類降解中，‘臍紅’在低溫的1 月表達顯著高于‘徐香’，猜測其通過降解其他糖類累積可溶性糖以抵御低溫。差異表達基因富集通路顯示，‘臍紅’與‘徐香’的低溫基因表達模式有所區別，在植物激素信號轉導中最明顯，大部分基因在2 個品種中具有不同的表達模式。

圖6 差異通路基因表達圖譜

從差異表達基因中篩選出蛋白分泌基因（Anch273941）、蠟質合成基因（Achn098691）和植物激素相關基因（Achn253311、Achn180501、Achn054121）5 個基因，qRT-PCR 測定其表達水平，并與轉錄組數據進行比較。5 個候選基因的qRTPCR 與轉錄組測序結果一致（圖7），說明轉錄組的數據相對準確。

圖7 差異表達基因驗證

3 討論

目前對作物低溫生理效應研究較多［16］，但是對植物越冬期間的低溫響應與調節研究較少。本研究發現獼猴桃的耐寒與不耐寒品種的基因表達具有較大差異，主要區別為低溫后的相關調節。從電導率和丙二醛含量的測定也能驗證‘臍紅’的低溫耐受性高于‘徐香’。‘臍紅’在整個降溫過程中上調基因數量減少，下調基因數量增加，與‘徐香’的區別較大，尤其在氣溫最低的1 月，二者在2 月的差異表達基因數量均升高，原因是2 月獼猴桃開始脫休眠進入生長發育狀態。‘臍紅’在12 月的特異差異表達基因比1 月少，但‘徐香’在溫度降低初期具有較多的差異表達基因，證實2 個品種在溫度降低的過程中具有不同的基因表達模式。

在GO 分類統計中，2 個品種在生物調節、細胞過程、代謝過程、細胞器、細胞部分、催化活性相關部分差異表達基因均較高，以上途徑均參與了植物應對低溫脅迫的響應。在‘臍紅’越冬過程中，細胞成分組織或生物生成、細胞器部分等差異表達基因數量增加，而‘徐香’與‘臍紅’差異表達基因數量沒有明顯增加。在KEGG 的分類統計中，尤其是在12 月至次年1 月，‘臍紅’的膜運輸、翻譯、轉錄、復制和修復等相關的差異表達基因減少，而在‘徐香’中并沒有明顯減少，說明2 個品種在低溫脅迫下自身的基因表達模式不同。在KEGG 富集中，二者均出現了MAPK 信號傳導途徑，低溫信號傳導涉及蛋白激酶通路［17］。‘臍紅’中有明顯的角質素、亞葉酸和蠟質途徑的差異表達，表明其在溫度降低的過程中發揮了重要作用，在‘徐香’中最特殊的是氨基酸的生物合成與代謝，包括精氨酸的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝。綜上，‘臍紅’與‘徐香’在低溫脅迫下的反應與調節機制有所區別。

在越冬期不同月份對比中發現，在氣溫最低的1 月出現了較多的糖類合成與代謝相關基因，低溫脅迫會觸發淀粉降解［18］，并將葡萄糖等轉運至液泡，通過在液泡中積累糖分增強植物的低溫耐受性［19］。在差異表達基因中，‘徐香’的糖類降解相關基因表達量較高，可溶性糖含量也相對較高，說明在低溫脅迫下通過調節糖類的降解以應對低溫環境。植物可以改變自身的角質素、蠟質的成分和數量來抵御外界脅迫［20-22］，植物表面蠟質可以增強植物對干旱、鹽、低溫脅迫的耐受性［23］，植物角質素、蠟質合成過程復雜，部分基因在低溫脅迫下被誘導高水平表達，形成抗寒屏障應對低溫環境。‘臍紅’中角質素、亞葉酸和蠟的生物合成相關基因表達顯著高于‘徐香’，同時，脂肪酸是合成角質素、亞葉酸和蠟的重要前體物質，C16 和C18 脂肪酸含量也會增多［24］。此外，植物激素在低溫響應中同樣具有重要作用，‘臍紅’與‘徐香’均在植物激素響應中具有較多的差異表達基因，包括色氨酸代謝、玉米素生物合成、二萜類化合物的生物合成、類胡蘿卜素的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、蕓苔素的生物合成、α-亞麻酸的代謝和苯丙氨酸的代謝。分析表明，植物激素、MAPK、糖類降解和氨基酸代謝等途徑在獼猴桃的低溫響應中發揮重要作用，其中，部分途徑如糖類代謝、角質素蠟質等途徑的差異性是‘臍紅’與‘徐香’在低溫脅迫下耐受性不同的主要原因。

4 結論

比較轉錄組分析顯示，越冬低溫期間，‘臍紅’與‘徐香’2 個品種的差異表達基因具有一定的相似性。但部分途徑基因存在表達差異，以上的分析結果為研究獼猴桃的越冬轉錄水平變化提供了新的見解，有助于進一步研究獼猴桃的低溫脅迫響應的潛在分子調節機制，為獼猴桃的低溫耐受性新品種培育提供理論基礎。