崔慶豐,李嫦娥,王 芳
(1.河北工程大學附屬醫院,河北 邯鄲 056001;2.秦皇島軍工醫院,河北 秦皇島 066000)
結腸癌是一種常見的惡性腫瘤,目前臨床上仍缺乏有效的治療手段。蛇床子素是一種提取自蛇床子的呋喃類香豆素化合物,能在多種惡性腫瘤中發揮抑癌作用[1-3]。蛇床子素可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[4],增強腎癌小鼠免疫系統功能,抑制腫瘤細胞增殖和遷移[5]。但是蛇床子素在結腸癌中的作用需要進一步研究。研究表明,Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)/髓樣細胞分化因子88(myeloid differentiation factor,MyD88)/核因子κB(nuclear factor,NF-κB)信號通路在結腸癌中被激活,穿心蓮內酯能通過抑制該信號通路發揮抗結腸癌作用[6]。本實驗擬探討蛇床子素是否能通過調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發揮抗結腸癌作用。
1.1 細胞系 人結腸癌SW480細胞系(批號:FS-0374)購自美國ATCC公司。
1.2 試劑 蛇床子素(純度≥98%,大連美侖生物技術有限公司,批號:MB6894);DMEM培養基(批號:12634010)、胰蛋白酶(批號:25200-056)、胎牛血清(批號:6140079)均購自美國Gibco公司;MTT試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司,批號:C0009);BCA試劑盒(批號:PC0020-500)、ECL發光液(批號:PE0010)均購自北京索萊寶生物科技有限公司;兔抗人TLR4 抗體(批號:ab22048)、兔抗人MyD88 抗體(批號:ab133739)、兔抗人NF-κB抗體(批號:ab141406)、兔抗人GAPDH抗體(批號:ab8245)均購自美國Abcam公司;山羊抗兔二抗(美國Biovision公司,批號:6903-250)。
1.3 主要儀器 SpectraMax iD5-多功能酶標儀(美國MD公司);DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠);CKX-41型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯);CLM-050B-8型二氧化碳恒溫培養箱(青島佳鼎分析儀器有限公司);MINI Space1000全自動凝膠圖像分析系統(上海天能生命科學有限公司)。
2.1 MTT法檢測細胞增殖情況 常規培養SW480細胞至第3代,制備單細胞懸液,取200 μL接種于6孔板,細胞貼壁生長后,分別用含不同濃度(0、50、100、200 μmol/L)蛇床子素的培養基培養,同時設置空白孔(只加入培養基),培養24 h后,加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL,重新培養4 h后,加入二甲基亞砜150 μL,震蕩混勻,測定450 nm波長處吸光度(A)值,計算細胞存活率。細胞存活率(%)=[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。
2.2 平板克隆實驗檢測細胞增殖情況 采用不同濃度(0、50、100、200 μmol/L)蛇床子素處理SW480細胞后,將細胞制成單細胞懸液,接種于6孔板,培養14 d,棄掉培養基,PBS清洗培養板2次,4%多聚甲醛固定細胞15 min,0.1%結晶紫染色15 min,風干后,計算各組細胞菌落數。
2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 采用不同濃度(0、50、100、200 μmol/L)蛇床子素處理SW480細胞后,制成單細胞懸液,密度為3×105/mL,取200 μL單細胞懸液接種于鋪滿基質膠的上室中,下室中加入600 μL完全培養基,將小室置于培養箱中24 h后,取出小室,濕棉簽擦去多余未遷移細胞,4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染色,顯微鏡下隨機選取3個視野觀察并計數。
SW480細胞遷移能力測定:除Transwell上室中不鋪滿基質膠外,其余操作同上。
2.4 蛋白印跡法檢測TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達 采用不同濃度(0、50、100、200 μmol/L)蛇床子素處理SW480細胞24 h后,加入裂解液裂解30 min,12 000 r/min離心10 min(離心半徑=8 cm),提取細胞中總蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度,加入5倍上樣緩沖液,100 ℃煮沸變性。120 V電泳2 h,0.3 A濕轉2 h,室溫封閉1 h,分別加TLR4、MyD88和NF-κB抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜,加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜,ECL發光液顯影,Image J分析條帶灰度值。
2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件分析數據,符合正態分布的計量資料均以(x±s)描述,多樣本計量資料比較采用單因素方差分析,兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。
3.1 各組細胞存活率比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組細胞存活率低于0 μmol/L蛇床子素組,且隨蛇床子素濃度的升高,細胞存活率逐漸降低(P<0.05)。(見表1)表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞增殖。
表1 各組細胞存活率比較 (±s)

表1 各組細胞存活率比較 (±s)
注:與0 μmol/L蛇床子素組比較,aP<0.05;與50 μmol/L蛇床子素組比較,bP<0.05;與100 μmol/L蛇床子素組比較,cP<0.05。
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3.2 各組細胞菌落數比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組細胞菌落數少于0 μmol/L蛇床子素組,且隨蛇床子素濃度的升高,細胞菌落數逐漸減少(P<0.05)。(見表2、圖1)表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞增殖。

圖1 平板克隆實驗檢測細胞增殖情況
表2 各組細胞菌落數比較 (±s)

表2 各組細胞菌落數比較 (±s)
注:與0 μmol/L蛇床子素組比較,aP<0.05;與50 μmol/L蛇床子素組比較,bP<0.05;與100 μmol/L蛇床子素組比較,cP<0.05。
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3.3 各組遷移細胞數比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組遷移細胞數少于0 μmol/L蛇床子素組,且隨蛇床子素濃度的升高,遷移細胞數逐漸減少(P<0.05)。(見表3、圖2)表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞遷移。

圖2 結晶紫染色檢測遷移細胞數 (×200)
表3 各組遷移細胞數比較 (±s)

表3 各組遷移細胞數比較 (±s)
注:與0 μmol/L蛇床子素組比較,aP<0.05;與50 μmol/L蛇床子素組比較,bP<0.05;與100 μmol/L蛇床子素組比較,cP<0.05。
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3.4 各組侵襲細胞數比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組侵襲細胞數少于0 μmol/L蛇床子素組,且隨蛇床子素濃度的升高,侵襲細胞數逐漸減少(P<0.05)。(見表4、圖3)表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞侵襲。

圖3 結晶紫染色檢測侵襲細胞數 (×200)
表4 各組侵襲細胞數比較 (±s)

表4 各組侵襲細胞數比較 (±s)
注:與0 μmol/L蛇床子素組比較,aP<0.05;與50 μmol/L蛇床子素組比較,bP<0.05;與100 μmol/L蛇床子素組比較,cP<0.05。
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3.5 各組TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對表達量均低于0 μmol/L蛇床子素組,且隨蛇床子素濃度的升高,TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量逐漸降低(P<0.05)。(見表5、圖4)表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達。

圖4 各組細胞中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達Western blotting 圖
表5 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相對表達量比較(±s)

表5 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相對表達量比較(±s)
注:與0 μmol/L蛇床子素組比較,aP<0.05;與50 μmol/L蛇床子素組比較,bP<0.05;與100 μmol/L蛇床子素組比較,cP<0.05。
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結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤,臨床上常采用手術、化療及靶向治療等方法治療本病,但術后易復發,化療存在較大毒副作用,且仍存在預后效果差、患者生存率低等問題。故探討結腸癌發生的具體機制、尋找有效的治療藥物具有重要意義[7]。
蛇床子素化學名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素,又稱為甲氧基歐芹酚。蛇床子素具有抗炎、抗氧化及鎮痛等多種藥理學活性[8-10]。研究發現,蛇床子素具有廣泛的抗腫瘤活性。楊娟等[11]研究表明蛇床子素可抑制視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、誘導癌細胞凋亡,且體內研究表明蛇床子素可抑制裸鼠視網膜母細胞瘤生長。蛇床子素可使前列腺癌LNCaP細胞周期阻滯在G2/M期,誘導癌細胞凋亡和衰老[12]。此外,蛇床子素可抑制舌鱗癌Tca8113細胞增殖,促進細胞凋亡,抑制細胞自噬,損傷細胞自噬途徑[13]。蛇床子素能通過促進促凋亡蛋白表達,抑制抗凋亡蛋白表達,阻礙卵巢癌SKOV3細胞增殖并誘導其凋亡[14]。由此可見,蛇床子素可通過多種途徑對惡性腫瘤發揮抑制作用,但是蛇床子素在結腸癌中的作用鮮有報道。
本研究結果顯示:SW480細胞經不同濃度蛇床子素處理后細胞存活率降低,平板克隆實驗表明細胞菌落數隨蛇床子素濃度升高而減少,Transwell實驗顯示遷移和侵襲細胞數隨蛇床子素濃度升高而減少。以上結果表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞增殖、遷移和侵襲。
在哺乳動物細胞中,普遍存在著TLRs家族。該家族屬于模式識別受體,行使著識別病原體相關模式分子的功能[15]。TLR4憑借特異性識別功能,使其能夠結合脂多糖(LPS);TLR4活化對促進固有免疫系統的抗原提呈細胞功能性成熟,并觸發促炎介質釋放具有重要作用[16-18];TLR4在細胞膜上識別并結合LPS后,LPS-TLR4復合物能在細胞膜啟動MyD88依賴的信號轉導途徑,將炎癥信號級聯傳遞到細胞內,使級聯反應持續發生。轉錄因子NF-κB發生核移位進入細胞核后,可調控早期炎癥介質的合成分泌[19-21]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在惡性腫瘤中異常表達。LI C等[22]研究發現,淫羊藿苷能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活,降低宮頸癌炎癥反應,誘導癌細胞凋亡,調節腫瘤細胞免疫反應。姜黃素能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路降低腎細胞癌炎癥反應,促進促凋亡蛋白表達,抑制抗凋亡蛋白表達,從而發揮抗腎細胞癌作用[23]。金剛烷連接的異硫脲衍生物能通過抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號通路抑制實驗性肝癌生長[24]。參苓白術散可降低Lewis肺癌小鼠TLR4、MyD88蛋白表達水平,增加Caspase-3蛋白表達水平,并能通過調控TLR4/MyD88通路,促進腫瘤細胞凋亡[25]。由此可見,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在惡性腫瘤的進展中發揮了重要作用。因此,本研究通過蛋白印跡法檢測蛇床子素對該信號通路的調節作用,結果表明:TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量隨蛇床子素濃度的升高逐漸降低,說明蛇床子素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活。
綜上所述,蛇床子素可抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲,其可能是通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發揮作用。