蛇床子素介導TLR4/MyD88/NF-κB信號轉導通路調控結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲*

崔慶豐，李嫦娥，王 芳

（1.河北工程大學附屬醫院，河北 邯鄲 056001；2.秦皇島軍工醫院，河北 秦皇島 066000）

結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，目前臨床上仍缺乏有效的治療手段。蛇床子素是一種提取自蛇床子的呋喃類香豆素化合物，能在多種惡性腫瘤中發揮抑癌作用[1-3]。蛇床子素可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[4]，增強腎癌小鼠免疫系統功能，抑制腫瘤細胞增殖和遷移[5]。但是蛇床子素在結腸癌中的作用需要進一步研究。研究表明，Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）/髓樣細胞分化因子88（myeloid differentiation factor，MyD88）/核因子κB（nuclear factor，NF-κB）信號通路在結腸癌中被激活，穿心蓮內酯能通過抑制該信號通路發揮抗結腸癌作用[6]。本實驗擬探討蛇床子素是否能通過調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發揮抗結腸癌作用。

1 材料

1.1 細胞系 人結腸癌SW480細胞系（批號：FS-0374）購自美國ATCC公司。

1.2 試劑 蛇床子素（純度≥98%，大連美侖生物技術有限公司，批號：MB6894）；DMEM培養基（批號：12634010）、胰蛋白酶（批號：25200-056）、胎牛血清（批號：6140079）均購自美國Gibco公司；MTT試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：C0009）；BCA試劑盒（批號：PC0020-500）、ECL發光液（批號：PE0010）均購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人TLR4 抗體（批號：ab22048）、兔抗人MyD88 抗體（批號：ab133739）、兔抗人NF-κB抗體（批號：ab141406）、兔抗人GAPDH抗體（批號：ab8245）均購自美國Abcam公司；山羊抗兔二抗（美國Biovision公司，批號：6903-250）。

1.3 主要儀器 SpectraMax iD5-多功能酶標儀（美國MD公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；CKX-41型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）；CLM-050B-8型二氧化碳恒溫培養箱（青島佳鼎分析儀器有限公司）；MINI Space1000全自動凝膠圖像分析系統（上海天能生命科學有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞增殖情況 常規培養SW480細胞至第3代，制備單細胞懸液，取200 μL接種于6孔板，細胞貼壁生長后，分別用含不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素的培養基培養，同時設置空白孔（只加入培養基），培養24 h后，加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，重新培養4 h后，加入二甲基亞砜150 μL，震蕩混勻，測定450 nm波長處吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=[（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）]×100%。

2.2 平板克隆實驗檢測細胞增殖情況 采用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素處理SW480細胞后，將細胞制成單細胞懸液，接種于6孔板，培養14 d，棄掉培養基，PBS清洗培養板2次，4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.1%結晶紫染色15 min，風干后，計算各組細胞菌落數。

2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 采用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素處理SW480細胞后，制成單細胞懸液，密度為3×105/mL，取200 μL單細胞懸液接種于鋪滿基質膠的上室中，下室中加入600 μL完全培養基，將小室置于培養箱中24 h后，取出小室，濕棉簽擦去多余未遷移細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取3個視野觀察并計數。

SW480細胞遷移能力測定：除Transwell上室中不鋪滿基質膠外，其余操作同上。

2.4 蛋白印跡法檢測TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達 采用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素處理SW480細胞24 h后，加入裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心10 min（離心半徑=8 cm），提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入5倍上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性。120 V電泳2 h，0.3 A濕轉2 h，室溫封閉1 h，分別加TLR4、MyD88和NF-κB抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL發光液顯影，Image J分析條帶灰度值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件分析數據，符合正態分布的計量資料均以（x±s）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組細胞存活率比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組細胞存活率低于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，細胞存活率逐漸降低（P＜0.05）。（見表1）表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞增殖。

表1 各組細胞存活率比較 （±s）

表1 各組細胞存活率比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

?

3.2 各組細胞菌落數比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組細胞菌落數少于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，細胞菌落數逐漸減少（P＜0.05）。（見表2、圖1）表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞增殖。

圖1 平板克隆實驗檢測細胞增殖情況

表2 各組細胞菌落數比較 （±s）

表2 各組細胞菌落數比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

?

3.3 各組遷移細胞數比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組遷移細胞數少于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，遷移細胞數逐漸減少（P＜0.05）。（見表3、圖2）表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞遷移。

圖2 結晶紫染色檢測遷移細胞數 （×200）

表3 各組遷移細胞數比較 （±s）

表3 各組遷移細胞數比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

?

3.4 各組侵襲細胞數比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組侵襲細胞數少于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，侵襲細胞數逐漸減少（P＜0.05）。（見表4、圖3）表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞侵襲。

圖3 結晶紫染色檢測侵襲細胞數 （×200）

表4 各組侵襲細胞數比較 （±s）

表4 各組侵襲細胞數比較 （±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

?

3.5 各組TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量比較 50、100、200 μmol/L蛇床子素組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對表達量均低于0 μmol/L蛇床子素組，且隨蛇床子素濃度的升高，TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量逐漸降低（P＜0.05）。（見表5、圖4）表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達。

圖4 各組細胞中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達Western blotting 圖

表5 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相對表達量比較（±s）

表5 各組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相對表達量比較（±s）

注：與0 μmol/L蛇床子素組比較，aP＜0.05；與50 μmol/L蛇床子素組比較，bP＜0.05；與100 μmol/L蛇床子素組比較，cP＜0.05。

?

4 討論

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，臨床上常采用手術、化療及靶向治療等方法治療本病，但術后易復發，化療存在較大毒副作用，且仍存在預后效果差、患者生存率低等問題。故探討結腸癌發生的具體機制、尋找有效的治療藥物具有重要意義[7]。

蛇床子素化學名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，又稱為甲氧基歐芹酚。蛇床子素具有抗炎、抗氧化及鎮痛等多種藥理學活性[8-10]。研究發現，蛇床子素具有廣泛的抗腫瘤活性。楊娟等[11]研究表明蛇床子素可抑制視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、誘導癌細胞凋亡，且體內研究表明蛇床子素可抑制裸鼠視網膜母細胞瘤生長。蛇床子素可使前列腺癌LNCaP細胞周期阻滯在G2/M期，誘導癌細胞凋亡和衰老[12]。此外，蛇床子素可抑制舌鱗癌Tca8113細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制細胞自噬，損傷細胞自噬途徑[13]。蛇床子素能通過促進促凋亡蛋白表達，抑制抗凋亡蛋白表達，阻礙卵巢癌SKOV3細胞增殖并誘導其凋亡[14]。由此可見，蛇床子素可通過多種途徑對惡性腫瘤發揮抑制作用，但是蛇床子素在結腸癌中的作用鮮有報道。

本研究結果顯示：SW480細胞經不同濃度蛇床子素處理后細胞存活率降低，平板克隆實驗表明細胞菌落數隨蛇床子素濃度升高而減少，Transwell實驗顯示遷移和侵襲細胞數隨蛇床子素濃度升高而減少。以上結果表明蛇床子素可抑制結腸癌SW480細胞增殖、遷移和侵襲。

在哺乳動物細胞中，普遍存在著TLRs家族。該家族屬于模式識別受體，行使著識別病原體相關模式分子的功能[15]。TLR4憑借特異性識別功能，使其能夠結合脂多糖（LPS）；TLR4活化對促進固有免疫系統的抗原提呈細胞功能性成熟，并觸發促炎介質釋放具有重要作用[16-18]；TLR4在細胞膜上識別并結合LPS后，LPS-TLR4復合物能在細胞膜啟動MyD88依賴的信號轉導途徑，將炎癥信號級聯傳遞到細胞內，使級聯反應持續發生。轉錄因子NF-κB發生核移位進入細胞核后，可調控早期炎癥介質的合成分泌[19-21]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在惡性腫瘤中異常表達。LI C等[22]研究發現，淫羊藿苷能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活，降低宮頸癌炎癥反應，誘導癌細胞凋亡，調節腫瘤細胞免疫反應。姜黃素能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路降低腎細胞癌炎癥反應，促進促凋亡蛋白表達，抑制抗凋亡蛋白表達，從而發揮抗腎細胞癌作用[23]。金剛烷連接的異硫脲衍生物能通過抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號通路抑制實驗性肝癌生長[24]。參苓白術散可降低Lewis肺癌小鼠TLR4、MyD88蛋白表達水平，增加Caspase-3蛋白表達水平，并能通過調控TLR4/MyD88通路，促進腫瘤細胞凋亡[25]。由此可見，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在惡性腫瘤的進展中發揮了重要作用。因此，本研究通過蛋白印跡法檢測蛇床子素對該信號通路的調節作用，結果表明：TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量隨蛇床子素濃度的升高逐漸降低，說明蛇床子素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活。

綜上所述，蛇床子素可抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，其可能是通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發揮作用。