治傷巴布劑3種藥物組分交互作用的實驗研究*

鐘 佳，孔祥建，丁 軒，楊 潔，何運恒，李 前

（1.常德市第一中醫醫院，湖南 常德 415000；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

[關鍵字] 治傷巴布劑；軟組織損傷；前列腺素E2；交互作用；正交試驗

急性軟組織損傷是一種臨床常見的損傷，損傷后疼痛腫脹等癥狀對人的健康和工作能力有重大影響，受到人們的廣泛關注[1]。休息制動、外固定保護、冰敷、壓縮和抬高仍然是急性軟組織損傷目前認可度較高的治療方法之一[2]。但隨著社會的進步，人們迫切的需要一種更加有效促進急性軟組織損傷修復的治療手段。治傷巴布劑是由我院老中醫方云祥祖傳秘方“治傷散”通過劑型改良而來，主要由血殼、虎杖、見風消等藥物組成。在臨床治療過程中，發現治傷巴布劑對急性軟組織損傷[3]、頸肩腰腿痛等疾病有著顯著的療效。前期研究[4-6]發現，治傷巴布劑通過調節軟組織中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的表達水平影響軟組織損傷的恢復進程。為了明確治傷巴布劑各組分在促進軟組織腫脹消退作用的主次地位及各組分間是否有交互作用，課題組開展本次研究，擬從軟組織形態學表現及骨骼肌中PGE2含量的角度，探討治傷巴布劑中主要作用成分，以及3個組分間是否存在交互作用，現將結果總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級6月齡健康雄性SD大鼠108只，均由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司出售，動物生產許可證號：SCXK（湘）2011-0003，動物使用許可證號：SCXK（湘）2013-0005，飼養溫度（22±3）℃，濕度（60±10）%，體質量（320±30）g，動物一般狀態良好，皮毛光澤，進食與活動正常，并有飼養員按要求定時提供標準飼料和飲用水。動物通過造模、給藥、取標本等處理后，過量硫噴妥鈉腹腔內注射處死大鼠。動物實驗設計方案已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 治傷巴布劑組方藥味來源:血殼為我院祖傳秘藥，一直以來由本單位在民間采購（桃源、石門等地，批號：120608），后經湖南中醫藥大學主任藥師童巧珍鑒定，為小血藤、香巴戟、鐵箍散類藥物，其主要藥理成分目前正在研究；虎杖（安徽嘉佑，批號：20140301）；見風消（湖南善德堂，批號：140815）。以上中藥均由常德市第一中醫醫院中藥房提供，血殼、虎杖主要取用根莖入藥，見風消取用枝葉入藥，經藥學部認定為正品。

治傷巴布劑的制備：3種藥物各研末過1號篩，用4倍劑量的85%乙醇浸泡48 h，用乙醇滲漉法收集滲液，通過濃縮、滅菌后，密封備用，最終得到藥物質量濃度為每1 mL藥物浸膏相當于5.0 g生藥。取適量明膠，用少量蒸餾水溶脹后90 ℃水浴溶解，加入適量甘油、阿拉伯膠和水，調成糊狀混合物，溶解后加入CaCl2，攪拌得基質，另取上述藥物浸膏，加熱攪拌，緩慢加入基質中，持續攪拌，置入90 ℃水浴中以去除部分水分，至膏體軟硬適中，再加入5%氮酮，繼續攪拌均勻，再均勻涂抹至無紡布上，置于40 ℃干燥箱中干燥30 min，再裁剪成5 cm×5 cm規格的巴布劑。所有巴布劑必須通過高效液相色譜儀及紫外分光光度儀進行有效成分及質量檢測，合格后方能使用。由常德市第一中醫醫院藥劑科制備。

RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒、組織裂解液和ECL發光液購自美國Therm公司；反轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；AQP3抗體購自美國Santa Cruz公司；PEG2酶聯免疫檢測試劑盒（江蘇酶標生物科技有限公司，批號：20150106）。

1.3 主要儀器 BS97MyCycler型PCR儀（美國Bio-Rad公司）；實時熒光定量9700型PCR儀（美國ABI公司）；Waters-960型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Mini-Sub Cell GT Cell型電泳儀及電泳槽、轉膜槽（美國Bio-Rad公司）；DNM-9606酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）；960CRT型熒光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；GIS-1000型數碼凝膠圖像分析系統（日本Kodak公司）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）；TCL16M型高速冷凍離心機（南京非同科學儀器有限公司）；UV754型紫外線可見分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；GRX-9053A型干烤滅菌器（上海柏欣儀器設備廠）。

1.4 造模與分組 將108只大鼠進行編號，按兩水平正交試驗設計，3種藥物組分A（血殼）、B（虎杖）、C（見風消）均取敷藥與不敷藥（外敷賦形劑）兩個水平，各藥物組分劑量水平見表1。

表1 各藥物組分的因子和劑量水平

采用L8（27）正交表進行實驗設計，組成9個處方組進行實驗，確定各藥物組分的主次地位及交互作用[18]，分別命名為Ⅰ～Ⅸ組：Ⅰ組（血殼+虎杖+見風消組）、Ⅱ組（血殼+虎杖組）、Ⅲ組（血殼+見風消組）、Ⅳ組（血殼組）、Ⅴ組（虎杖+見風消組）、Ⅵ組（虎杖組）、Ⅶ組（見風消組）、Ⅷ組（賦形劑對照組）、Ⅸ組（正常對照組），每組12只大鼠。

造模前一天使用10%的硫化鈉對大鼠左后肢大腿外側進行脫毛，用1%硫噴妥納（0.5 mL/100 g）腹腔注射進行全身麻醉，再使用軟組織打擊器（重錘墜落法）在脫毛區標記處（直徑約2 cm）進行打擊造模，建立創傷性軟組織腫脹模型，對Ⅰ～Ⅷ組大鼠進行造模，Ⅸ組不進行處理。打擊錘底面平滑，直徑為2.5 cm，重200 g，自由落體的高度為20 cm，連續打擊3次，以肉眼可見打擊部位腫脹和皮下淤血但無骨折為造模成功。

1.5 實驗給藥 將各組藥物浸膏各取50 mL，按治傷巴布劑組分配比，按以上制作工藝，制作成同等大小及數量的巴布劑，并裁成3 cm×3 cm小塊，造模后立即使用膠布包裹將藥物或賦形劑分別敷于Ⅰ～Ⅷ組大鼠左后肢腫脹區，并記錄造模及敷藥時間，膠布包裹時松緊適宜，避免過緊導致局部循環不暢，加重腫痛，影響實驗結果。定期觀察各藥物組大鼠左側后肢敷藥情況，如有藥物脫落，及時添補。

1.6 觀察指標 于造模后7 d處死大鼠，在造模部位中心區域切取骨骼肌約2 g，并將其等分為5份，用生理鹽水清洗血跡后立即置于2 mL凍存管，并用液氮冷凍，-80 ℃低溫冰箱保存。

每個樣本取骨骼肌組織1份，依次進行脫水、石蠟包埋、切片等處理,將石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤1～2 h，石蠟切片常規二甲苯脫蠟，乙醇沖洗至水；蘇木素染10 min，流水沖洗，去余色；0.7%鹽酸乙醇分化數秒鐘，流水沖洗，切片變藍約15 min；95%乙醇30 s，酒精性伊紅染色30 s；95%乙醇30 s，100%乙醇30s，石碳酸二甲苯30s，二甲苯脫水30s，中性樹膠封片。

1.6.1 組織病理學檢查 在顯微鏡下觀察各標本淤血、腫脹程度,分別對各組行四級評分，鏡下觀察及評分標準[2-3]如下：0分：肌纖維無淤血、腫脹，與正常軟組織相同；1分：肌纖維有腫脹，肌組織內輕度淤血、水腫、出血，血管及膠原纖維輕度增生；2分：肌纖維有腫脹，并伴有變性，肌纖維內輕度淤血、水腫、出血，纖維母細胞侵入，血管增生或膠原纖維增生明顯；3分：肌纖維腫脹明顯，并伴有透明變性，肌纖維組織中伴有嚴重淤血、水腫、出血、炎癥，肌纖維明顯壞死。

1.6.2 PGE2含量 取骨骼肌樣本約100 mg，采用酶聯免疫法（ELISA）檢測各時間點規定區域骨骼肌中PGE2含量。生理鹽水5mL浸泡1h，離心浸泡液，吸取上清液0.1 mL，加0.5 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液2 mL，在50 ℃水浴中異構化20 min，用甲醇稀釋至20 mL，于波長270 nm處測定光密度值（OD），以每克組織相當的吸收光密度值表示PGE2的含量。

1.7 統計學方法 所有數據均使用SPSS 20.0軟件系統進行錄入及處理，符合正態分布的計量資料用（x±s）表示，如組間方差齊，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織病理學改變情況 大鼠造模后骨骼肌組織均腫脹淤血，敷藥7 d后，Ⅰ組（血殼+虎杖+見風消組）基本無明顯腫脹淤血；Ⅱ組（血殼+虎杖組）、Ⅲ組（血殼+見風消組）、Ⅳ組（血殼組）輕度淤血腫脹，較Ⅰ組稍明顯，出血灶較Ⅰ組明顯減輕或大部分消失，血管增生，膠原纖維增生；Ⅴ組（虎杖+見風消組）、Ⅵ組（虎杖組）、Ⅶ組（見風消組）均淤血腫脹，肌纖維腫脹且伴有輕度變性，肌組織內淤血、水腫、出血稍減輕，纖維母細胞侵入，血管及膠原纖維輕度增生；Ⅷ組（賦形劑對照組）腫脹淤血明顯，肌纖維腫脹且有透明變性，肌纖維明顯壞死，肌纖維組織中伴有嚴重淤血、水腫、出血、炎癥；Ⅸ組（正常對照組）為正常骨骼肌組織，無腫脹瘀血。（見圖1）

圖1 各組大鼠骨骼肌病理切片圖 （HE，×200）

2.2 PGE2含量 根據表2可以看出，藥物A的極差最大，對結果影響最大，其次是B、C，說明主要藥物為血殼，次要藥物為虎杖及見風消。

表2 治傷巴布劑對大鼠軟組織腫脹的療效 （±s）

表2 治傷巴布劑對大鼠軟組織腫脹的療效 （±s）

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結合表2、表3可以看出，藥物A、B、C都有作用，A+B存在交互作用（P＜0.05），但極差R＜0，說明血殼與虎杖有交互作用，且交互性質為拮抗作用，其他藥物組合無交互作用（P＞0.05）。

表3 治傷巴布劑對大鼠軟組織腫脹療效的方差分析

3 討論

急性軟組織損傷是臨床非常常見的疾病，一般由外力導致，其主要病理改變是無菌性炎癥，主要表現為局部肌肉組織壞死、毛細血管擴張、白細胞浸潤、水腫和出血[7]。急性軟組織損傷的發病機制中，中性粒細胞起著重要作用，它從創傷性病變中早期釋放出來，誘導自由基，進而損傷局部組織細胞[1]。中性粒細胞能釋放大量炎癥介質，包括PGE2、IL-1β、TNF-α、花生四烯酸代謝物、血管活性胺等，這些炎性介質能進一步加劇炎癥細胞的黏附聚集作用，促進炎癥因子的進一步釋放，同時激活新的炎癥反應[8]。研究[9-10]表明，PGE2是花生四烯酸在磷酸酯酶A2作用下的最終代謝產物，PGE2不僅能通過下調神經根的疼痛閾值和增加神經的敏感性直接導致疼痛，而且能促進血管攣縮導致軟組織水腫加劇，是導致急性軟組織損傷疼痛和腫脹的重要原因。因此PGE2是急性軟組織腫脹的重要病理因素，也是藥物干預的主要作用靶點[12-13]。

中醫學認為，急性軟組織損傷屬于“筋傷病”范疇，跌仆損傷導致機體筋脈受損，血逸脈外而成瘀，瘀血阻脈導致氣機運行不暢，故發為腫痛，所以說“氣滯血瘀”為其基本病機[11]。《普濟方》云：“但凡傷折，損及筋肉經絡，脈絡暢通受阻，瘀停不去，故引發腫痛，治宜祛除惡瘀，宣通脈道，暢通氣血，則病可愈。”我院名老專家邵先舫教授多年來從“脾”論治創傷后軟組織損傷，取得良好療效[14-15]，因此，治療急性軟組織損傷的基本準則是“活血化瘀、消腫止痛”基礎上兼以健脾利水，能取得良好療效。治傷巴布劑是由我院老中醫方云祥的祖傳秘方“治傷散”通過劑型改良而成，主要由血殼、虎杖、見風消等藥物組成。血殼味苦，性寒，善于祛腐生肌，消腫止痛。虎杖性微苦，味微寒，善于散瘀消痛。見風消，味辛，性溫，善于祛風除濕，行氣散寒止痛。三藥合用，藥性相互制約防止寒涼太過，又具有活血通絡、散瘀消腫止痛之功效，且中草藥外敷較藥物內服更具安全性[16-17]。

本研究采用大鼠腫脹模型，設計正交試驗，建立大鼠腫脹模型，通過檢測腫脹模型大鼠骨骼肌中PGE2含量，分析治傷巴布劑3種藥物組分治療創傷后組織腫脹的主次地位及交互作用，證實3種藥物組分均能降低PGE2含量，其中血殼起主要作用，而且血殼與虎杖之間存在拮抗作用，其他組分之間不存在交互作用。這提示雖然治傷巴布劑中各組分都能通過降低PGE2的表達治療急性軟組織損傷，但每一組分應該均存在不同的治療靶點，3種藥物通過不同的治療機制構建出治傷巴布劑治療急性軟組織損傷的干預機制網絡。但是本研究只是初步分析了3種藥物對PGE2的干預作用，對于其他可能存在的治療靶點及作用機制的分析還有待進一步的探索與研究。