茵陳四苓湯對酒精性肝損傷大鼠腸黏膜屏障ZO-1及occludin的影響*

王曼菲，肖肽平，趙好好，馬祺鑫，艾碧琛

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），又稱為酒精性肝損傷，是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病。ALD初期通常表現為單純性脂肪肝，進而可發展成酒精性肝脂肪變、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化，嚴重酗酒時可誘發廣泛肝細胞壞死，甚至肝功能衰竭[1]。研究表明，ALD的主要病因是乙醇的過度攝入，但該疾病的發生發展過程則與多種因素有關[2]。腸黏膜屏障（intestinal barrier function，IBF）是阻止腸道內細菌及內毒素進入的第一道防線。自1988年馬歇爾提出“腸-肝軸”理論后[3]，腸黏膜屏障及其功能在ALD形成過程中的作用及機制逐漸成為研究熱點。近年來，大量研究[4-6]表明酒精可造成腸道損傷，使得腸道通透性增加，引起內毒素（lipopolysaccharide，LPS）腸滲漏。LPS具有高度的免疫活性，可隨著ALD進展而泛濫進入循環系統，激活炎癥因子，導致促炎癥因子瀑布式釋放，形成腸源性內毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM），對肝臟進行第二次打擊，誘導并加重肝損傷，同時又可加劇腸黏膜屏障的損害，形成惡性循環。因此，臨床對于肝病的防治日益重視對IBF的保護，了解腸黏膜屏障在ALD中的保護作用并探討其相關性具有重要的臨床意義。茵陳四苓湯出自《杏苑春生》，具有清熱利濕、利膽退黃的功效[7]。實驗研究顯示，茵陳四苓湯具有護肝抗炎、改善肝纖維化的作用[8]。臨床研究也證實，茵陳四苓湯治療以濕熱為主的肝病效果顯著[9-10]。本研究以腸黏膜機械屏障為中心，通過觀察茵陳四苓湯對酒精性肝損傷大鼠腸黏膜血清閉鎖小帶蛋白-1（Zonula occludens-1，ZO-1）和閉鎖蛋白（occludin）的影響，探討本方防治ALD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只，體質量（180±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SYXK（湘2019-0009），動物合格證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于SPF級動物飼養室，室溫20~26 ℃，每籠2~3只，自由飲水及進食，每日交替12 h的光明與黑暗周期。本研究已通過湖南中醫藥大學動物倫理委員會的審核，實驗過程中嚴格按照《實驗動物管理條例》，遵循人道主義原則，確保實驗動物的福利倫理，批準編號為：LL2021032404。

1.2 藥物與試劑 雙環醇（北京協和藥廠，規格：25mg×18粒/盒，批號：201204）；茵陳四苓湯（方藥組成：茵陳、澤瀉、白術各15 g，枳實、豬苓各10 g，山梔子6 g），飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院；高脂飼料[11-13]（77.5%基礎飼料+10%豬油+2%蔗糖+8%蛋黃粉+2%膽固醇+0.5%膽鹽），由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供；白酒為乙醇體積分數為56%的北京紅星二鍋頭。總膽固醇（TC）試劑盒（批號：10412001H）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號：10408002H）、谷丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號：20210728-J8477）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號：20210728-J8478）、脂多糖（LPS）試劑盒（批號：20210728-J3243）、大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號：20210728-J3056）、大鼠白細胞介素10（IL-10）試劑盒（批號：20210728-J3071）均由湖南艾方生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器 真空采血管（山東省成武縣華博醫療器械有限公司，普通管、EDTA2K）；離心沉淀機[微量高速離心機（國產），TG16W]；電熱恒溫培養箱（武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司，DHP-9012）；移液槍（Finnpipette，4641020N）；洗板機（Tianshi，988洗板機）；酶標儀（Rayto，RT-6100）；恒溫搖床（上海赫田科學儀器有限公司，HT-111B）；熒光分光光度計（BioTeck，Epoch）。

1.4 造模與分組 采用高脂飼料加白酒灌胃方式建立酒精性肝損傷模型[14-16]。50只大鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為空白組（n=15）和實驗組（n=35）。空白組予普通飼料喂養，蒸餾水灌胃；其余大鼠用高脂飼料喂養，用乙醇體積分數為56%的白酒灌胃。各組大鼠灌胃量為1 mL/100 g，每周記錄體質量1次，根據體質量調整灌胃量。因酒精過敏、灌胃操作不當、大鼠之間斗毆等導致部分大鼠在實驗過程中死亡。12周后，隨機抽取空白組（n=11）及實驗組（n=22）大鼠各5只，檢測肝功能并取相同部位肝組織HE染色觀察組織形態學改變，若實驗組大鼠出現明顯的肝細胞脂肪變、氣球樣變及部分炎癥細胞浸潤，且肝功能與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），則造模成功。

1.5 實驗給藥 將造模成功的17只實驗組大鼠，按隨機數字表法分為模型組、雙環醇組、茵陳四苓湯組（以下簡稱茵四組），分別為5只、6只、6只。根據人與動物體表面積-劑量換算法，以70 kg成人劑量進行換算，按照茵陳四苓湯組成比例，將所有藥物浸泡1 h后，水煎2次，每次30 min，合并2次濾液，將茵陳四苓湯濃縮至含生藥1.07 g/mL，雙環醇以0.5%CMC-NA水溶液配制成100 mg/10 mL混懸液，置于4 ℃冰箱保存備用。雙環醇組及茵四組大鼠給予相應藥液灌胃，空白組及模型組大鼠以蒸餾水灌胃，每次灌胃量為1 mL/100 g，每日2次（09:00:00和15:00:00各1次），連續給藥4周。每周稱體質量1次，以便根據體質量調整灌胃量。

1.6 觀察指標 末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈采血，2000r/min離心15 min后，提取血清及血漿，置于-20 ℃冰箱保存備用；切除完整肝臟，取肝左葉部分肝組織裝入EP管中，用液氮速凍，-80 ℃保存，另取肝左葉5 mm×5 mm×5 mm大小肝組織，置于4%多聚甲醛溶液固定；取臨近回盲部（＜4 cm）的近端結腸組織，用4%多聚甲醛固定。

1.6.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態、體質量及死亡情況。

1.6.2 肝組織病理學觀察 取肝組織，4%多聚甲醛固定，常規脫水處理、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學改變。

1.6.3 血清相關生化指標及血漿內毒素測定 采用ELISA檢測血清ALT、AST、TC、TG水平；提取血漿，用ELISA法檢測LPS含量，以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.4 激活KCs后的炎癥反應 取部分肝組織，用ELISA法檢測肝臟組織TNF-α及IL-10水平，觀察LPS激活KCs后的炎癥反應。具體操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.5 結腸組織ZO-1、occludin表達 取結腸組織，用免疫組化法檢測相關蛋白表達。每組選取5個樣本，分別隨機觀察3個視野，通過Image Pro Plus測定陽性表達的灰度值和面積，計算平均吸光度（MOD）。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。計量資料以“均數±標準差“（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析，兩兩比較滿足方差齊性用LSD法，不滿足方差齊性則選用Dunnett’T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 空白組大鼠體型正常，皮毛有光澤，精神佳，活動靈活，飲食正常；模型組、雙環醇組、茵四組大鼠體型較胖，毛色枯槁晦暗，精神欠佳，倦怠，食量減少。

2.2 各組大鼠肝組織病理形態觀察 空白組大鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，呈放射狀，肝細胞形態規則，無明顯脂肪樣變，未見明顯炎癥細胞浸潤及壞死。模型組大鼠肝細胞體積增大，細胞內出現大量的脂肪細胞堆積，可見大量脂滴空泡形成，肝索排列紊亂，肝竇擠壓變窄，伴有不同程度炎癥細胞浸潤、壞死，可見氣球樣變或纖維樣變。雙環醇組和茵四組肝細胞較模型組脂肪變性均有改善，程度不等，肝索排列也相對整齊，肝細胞形態尚規則，炎癥浸潤情況也明顯減輕。（見圖1）

圖1 各組大鼠肝組織形態 （HE 染色，×200）

2.3 各組大鼠血生化結果及LPS水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，雙環醇組及茵四組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見表1）

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS 比較 （±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LPS 比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與雙環醇組比較，dP＜0.05，eP＜0.01。

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2.4 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-10水平比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α水平升高（P＜0.01），IL-10水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，雙環醇組及茵四組大鼠肝組織TNF-α水平均降低（P＜0.01），IL-10水平均升高（P＜0.01）。（見表2）

表2 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-10 水平比較 （±s，pg/g）

表2 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-10 水平比較 （±s，pg/g）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01，與雙環醇組比較，cP＜0.01。

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2.5 各組大鼠結腸組織ZO-1、occludin表達比較 空白組大鼠結腸ZO-1、occludin陽性表達較多，黏膜上皮細胞著色較深，呈棕褐色；模型組大鼠結腸組織ZO-1、occludin相對減少，著色較淺；雙環醇組與茵四組大鼠結腸組織陽性表達與模型組相比有所增加，著色程度也有不同程度加深。（見圖2）與空白組比較，模型組大鼠結腸組織ZO-1、occludin蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，雙環醇組及茵四組大鼠結腸組織ZO-1、occludin表達升高（P＜0.01）。（見表3）

圖2 各組大鼠結腸組織ZO-1、occludin 蛋白表達 （免疫組化，×200）

表3 各組大鼠結腸組織ZO-1、occludin表達比較（±s，MOD）

表3 各組大鼠結腸組織ZO-1、occludin表達比較（±s，MOD）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

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3 討論

酒精性肝損傷已成為歐美等發達地區肝硬化形成的首要病因，其發病機制錯綜復雜。近十余年來研究顯示，除酒精大量蓄積引起肝損傷外，腸道微生物組成比例改變，即生態失調、微生物及其代謝產物、細菌易位導致腸道屏障功能障礙、內毒素血癥、機體免疫損傷也被認為是引發ALD的中心環節。越來越多的研究者們開始拓寬視野，逐漸將目光轉移到與肝病發生發展有關的其他因素及其關系中，而肝臟與腸道的關系正是目前被關注的重點。已有研究證實腸黏膜屏障參與肝功能惡化及肝性腦病的發生發展[17]。

腸和肝的緊密聯系始于胚胎發育期，他們共同起源于腹側前腸內胚層[18]。兩者在生理病理上緊密聯系，雙向溝通[19]。一方面，肝臟通過膽管排泄膽汁及其他生物活性介質與腸道溝通，影響腸道微生態；另一方面，代謝營養物通過門靜脈運輸到肝臟，同時腸道細菌及其產物、內毒素和炎癥介質也會通過門靜脈轉運，從而使得肝臟易受腸道微環境的影響而發生病理性改變。當腸黏膜屏障結構及功能受損時，腸黏膜通透性增加，腸道中大量細菌、內毒素及炎癥因子通過門靜脈進入肝臟；慢性肝病發生時，若腸黏膜通透性增加，進入體循環的內毒素含量也隨之增加，從而引發內毒素血癥造成肝微循環障礙，對肝臟進行第二次打擊，加重肝臟疾病[20]。大量研究[21-23]證實，酒精性或非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病的發生發展均與“腸-肝軸”有著密切關系。因此，“腸-肝軸”理論為肝臟疾病的治療打開新的思路——從腸治肝[24]。

內毒素是脂多糖的活性成分，而腸黏膜屏障正是防止其進入體循環的第一道防線。肝臟固有免疫系統也發揮著重要的防御作用。對于那些逃逸的內毒素，作為第二防線的肝臟可通過胞飲的形式將其吞噬，從而維持內環境穩定。無論是IBF功能障礙還是肝臟功能受損均可導致體內LPS的蓄積。LPS通過影響肝臟微循環直接損傷肝細胞，破壞肝竇內皮細胞和微血管，激活凝血系統，導致微血栓形成，加重肝細胞損傷和加快肝纖維化過程。此外，LPS還可通過影響炎癥因子、內源性介質等間接造成肝損傷，LPS與細胞膜上的受體結合后激活肝內外單核-巨噬細胞系統，通過絲裂原活化蛋白激酶通路、PKC通路、NF-κB通路[25]等，誘導細胞內腫瘤壞死因子TNF-α、IL-10、NO等多種炎癥介質大量生成、釋放。因此明確LPS與ALD的關系，減輕炎癥反應，在治療ALD等慢性肝病方面至關重要。

本研究中，與空白組比較，模型組大鼠LPS水平顯著升高（P＜0.01），說明在高脂飼料加白酒刺激下模型組大鼠腸源性內毒素血癥形成。經治療后，與模型組比較，雙環醇組及茵四組LPS水平明顯降低（P＜0.01）；茵四組LPS水平低于雙環醇組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明茵陳四苓湯對減輕ALD模型大鼠血漿內毒素水平療效明顯，且茵陳四苓湯對于ALD模型大鼠體內LPS水平的改善效果優于雙環醇。模型組大鼠TNF-α水平顯著升高（P＜0.01），作為抗炎因子的IL-10水平則明顯降低（P＜0.01），說明模型組大鼠肝臟炎癥反應明顯。經治療后，雙環醇組及茵四組TNF-α水平明顯低于模型組（P＜0.01），IL-10水平也有所上升（P＜0.01）。說明茵陳四苓湯能有效降低ALD模型大鼠的TNF-α水平，激發抗炎因子釋放，改善炎癥反應，從而減少對肝臟的進一步損傷。除了降低LPS水平，減輕炎癥反應外，恢復腸道通透性、改善腸黏膜屏障功能也可以治療ALD。ZO-1和occludin是腸黏膜機械屏障中最重要的結構蛋白，可阻止細菌微生物、代謝產物和毒素的侵入，對腸黏膜屏障功能的正常發揮起著直接作用。本研究發現，經茵陳四苓湯治療后，ALD大鼠ZO-1、occludin表達增加（P＜0.01），ALT、AST、TC、TG水平均明顯降低（P＜0.05），說明茵陳四苓湯對腸黏膜機械屏障具有修復作用并能改善肝功能，調控脂代謝，這一結果論證了從腸治肝的可行性及有效性。

現代醫學所討論的腸道功能可歸于中醫“脾胃”所主范疇，而解剖學的肝臟則可與中醫“肝”的范疇相對應。肝脾理論的運用早在東漢時期就有所體現，如《金匱要略》中記載“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”[26]。這句話不僅闡述了肝病的傳變規律，還在《難經》的基礎上補充了治法。肝木患病易乘脾土。這既是中醫整體觀念的體現，也是對治未病思想的實踐。“實脾，則肝自愈”，因此，在治療肝病的同時，重視調補脾氣，使脾臟健運正常，不受邪侵，才能早日康復。此外，脾病亦可侮肝，早在《黃帝內經》[27]中便提出了相關理論：“氣有余，則制己所勝而侮所不勝；其不及，則己所不勝，侮而乘之，己所勝，輕而侮之”。肝病實脾、肝脾同治的學術思想一直被世人推崇并逐漸完善。如清代葉天士言“補脾必以疏肝，疏肝即以補脾也”，臨證多重視肝脾同調；張錫純在《醫學衷中參西錄》[28]中介紹到：“欲治肝者，原當升脾降胃，培養中宮，俾中宮氣化敦厚，以聽肝木自理”；再到后來“腸-肝軸”學說的提出。不難發現，西醫所提出的“腸-肝軸”實際上是對與中醫肝脾相關理論另一角度的補充。

中醫學認為ALD系酒酪不節所致，常與濕熱侵襲、情志不暢相關。大量飲酒造成脾胃運化失司，濕熱困脾，脾失健運，水濕內生，痰瘀互結，阻滯肝脈。臟腑上與肝脾最為密切，病機不外“濕熱”“氣滯”，辨證多屬濕熱內蘊，其特點為本虛標實。茵陳四苓湯由茵陳、白術、澤瀉、豬苓、山梔子、枳實組成。方中茵陳性微寒，味苦辛，歸脾、胃、肝、膽經，具有清利濕熱、利膽退黃的功效，使體內稽留之濕熱毒邪外出，同時還可暢達肝氣，使氣機升降功能得以恢復。現代研究表明，茵陳所含有的茵陳多肽能增強巨噬細胞的吞噬能力，降低TNF-α水平從而減輕炎癥反應，保護肝臟。此外，茵陳與山梔子合用還能穩定肝細胞膜，減少肝細胞凋亡，從而促進肝臟功能的恢復。白術歸脾、胃經，味甘苦，性溫，具有益氣健脾、燥濕利水之功，用以恢復脾土治水之功，顧護后天之本。澤瀉性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經，可利水滲濕泄熱。現代藥理研究發現其具有利尿、抗炎、降脂、護肝的作用[29]。豬苓味甘、平，性微熱，歸心、脾、胃、肺、腎經，具有祛寒利水、消腫滲濕之功效。山梔子性寒，味苦，入心、肝、肺、胃經，可入血分，加強清熱利濕涼血之效。枳實性微寒，味苦、辛、酸，歸脾、胃經，可以破氣消積，化痰散痞。《神農本草經》中記載枳實還具有“長肌肉，利五臟，益氣輕身”的功效。諸藥合用，共奏清熱解毒、利水滲濕、涼血止血、利膽退黃的功效，可用于治療酒精性肝損傷之濕熱蘊結證。根據上述“腸-肝軸”及肝脾相關理論，本方從“脾”入手，通過健運脾胃修復腸屏障功能從而達到“治肝”的目的。

綜上，茵陳四苓湯可增加ALD大鼠結腸ZO-1、occludin表達，調節炎癥因子TNF-α、IL-10水平，保護腸黏膜屏障，從而降低內毒素水平，改善肝功能，調控血脂。提示茵陳四苓湯可調節“腸-肝軸”，也為臨床“從腸治肝”防治慢性肝病提供了實驗依據。