基于網絡藥理學和體內實驗研究竹葉石膏湯治療痛風性關節炎的分子機制*

劉萬杰，翟偉林，劉文斐，鄒家輝，張秋靈，黃各寧，梁艷坤

（1.廣州市從化區中醫醫院，廣東 廣州 510999；2.廣州開發區醫院，廣東 廣州 510730；3.南方醫科大學第五附屬醫院，廣東 廣州 510999；4.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510045）

痛風性關節炎（gouty arthritis，GA）的發病率逐年上升，其以尿酸鹽和壞死組織為中心的痛風結節和纖維性血管翳造成受累組織炎癥反應及肉芽組織形成等[1-2]。隨著社會的發展，GA發病率逐年攀升，全球GA發病率為1%～15%[3]，GA帶來的慢性疼痛、殘疾及沉重的經濟負擔可導致焦慮、抑郁和自殺情緒。然而，長期服用非甾體抗炎藥物及秋水仙堿的GA患者常出現胃腸道和心血管副作用[4-5]。晚期GA主要接受關節鏡或關節置換手術，但手術費用高昂且術后并發癥多[6]。目前，GA的發病機制尚不完全明確且治療方式尚未達成共識。因此，有必要深入挖掘GA的發生、發展機制，并為GA的精準治療提供新的理論依據及診療指南。

竹葉石膏湯目前主要用于治療各種熱證、小兒疾病、GA等疾病[7]。當前研究發現，竹葉石膏湯具有抗炎、解熱、抗菌等功效[8]。此外，CHOI S等[9]研究發現，竹葉提取物可通過抑制氧化應激反應，抑制TNF-α誘導的VCAM-1表達，從而發揮抗血管性炎癥的作用。石膏主要成分為含水硫酸鈣，能抑制骨骼肌的興奮性，經胃酸消化后成為可溶性鈣鹽，可減少血管滲透性，抑制滲出液的形成[10-11]。ZHAO J W等[12]研究發現，麥冬提取物4-O-去甲基麥冬苷元E可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號傳導，降低一氧化氮和炎癥細胞因子的表達來發揮抗炎作用。YU T等[13]研究發現，人參皂苷Rc有顯著的抗炎活性，可以通過靶向結合p38/激活轉錄因子-2（ATF-2）途徑抑制炎癥反應發生。另外，有研究[14-15]發現人參皂苷Rc還能抑制白介素-1β（IL-1β）處理的人軟骨細胞中MMP-13的表達，從而起到保護軟骨細胞的作用。而GA通過多種信號傳導途徑將胞外信號傳遞到胞內，進一步釋放炎癥因子、趨化因子介導免疫炎癥反應[16]。因此，竹葉石膏湯可能具有較強的抗GA作用。故本研究通過網絡藥理學預測竹葉石膏湯的潛在藥理作用機制及其與GA相關靶點和通路的相互作用，并通過動物實驗進行驗證。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 竹葉石膏湯有效活性成分及篩選鑒定 將竹葉石膏湯的組成藥物“竹葉”“生石膏”“半夏”“麥門冬”“人參”“甘草”“粳米”輸入中藥藥理學系統數據庫（TCMSP）[17]及BATMANTCM[18]進行搜索。生物利用度（oral bioavailability，OB）表示口服藥物被吸收進入體內循環的速度和程度（包括藥物的生物利用度及利用速度）。類藥性（drug-likeness，DL）是一個基于現有藥物的理化性質和分子結構的概念，用于評價某一化合物與已知藥物的相似性。根據TCMSP/BATMAN-TCM數據庫常見的篩選標準及結合以往文獻結果[19-20]，選擇OB≥30%和DL≥0.18，或Score cutoff≥20，校正P＜0.05的活性成分進行后續分析研究。

1.1.2 靶標蛋白篩選及藥物-活性成分-靶點網絡構建 利用TCMSP/BATMAN-TCM數據庫對篩選得到的藥物活性成分進行靶點查詢，并將篩選所得所有靶蛋白名稱導入DrugBank數據庫（https:∥www.drugbank.ca/）及UniProt數據庫（https://www.uniprot.org）。設置物種為人類（Homo sapiens），對得到靶蛋白進行比對和基因名校正，轉換成標準的基因名，并刪除無對應基因名的靶蛋白。得到的藥物活性成分并與活性成分對應靶點建立對應關系。通過Cytoscape 3.7.2軟件得到藥物-活性成分-靶點交互作用網絡模型[19-20]。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyze”功能進行網絡拓撲學分析[21]，篩選得出核心活性成分及潛在靶基因。

1.1.3 GA基因表達譜獲取 在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）及OMIM數據庫（https://www.omim.org/）中下載與GA相關的基因，篩選條件：（1）痛風性關節炎；（2）人類；得到符合篩選標準的與GA相關的基因集。

1.1.4 藥物活性成分-痛風性關節炎靶點交集及交互網絡構建 利用在線韋恩圖制作網站Interacti Venn[22]（http://www.interactivenn.net/）對藥物活性成分靶點及疾病靶點中共同的靶基因進行韋恩圖展示，將得到的共同靶基因導入在線分析網站STRING構建蛋白-蛋白互作網絡[23]（protein-protein interaction，PPI）。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的BisoGenet插件[23]分別構建藥物活性成分靶點PPI及GA相關PPI網絡，利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyze”功能進行網絡拓撲學分析，將藥物活性成分PPI和GA相關基因PPI網絡進行合并，得到藥物活性成分和GA相關基因共有PPI網絡。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA插件對藥物活性成分靶點與GA相關基因共有PPI進行多中心網絡拓撲學計算，并根據Degree、中介中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心度（closeness centrality，CC）、局部平均連通度中心性（local average connectivity-based，LAC）、鄰域連通性（neighborhood connectivity，NC）值的中位數值進行篩選，得出竹葉石膏湯活性成分作用于GA的潛在核心靶基因。

1.1.5 靶基因GO/KEGG富集分析 為進一步探討竹葉石膏湯活性成分對GA的潛在作用機制及共同靶基因的功能，利用R語言中的Bioconductor包、clusterProfiler包對上一步得到的靶基因進行基因本體論（GO）和KEGG信號通路分析[24]。其中GO分析主要包括潛在靶基因的細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學過程（biological process，BP）。同時利用pathview包繪制相應的信號通路圖。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性Wistar大鼠36只，體質量（257.1±10.01）g，由廣州中醫藥大學三元里校區動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0034。飼養于廣州中醫藥大學SPF級動物房，溫度為25 ℃，相對濕度為37%。本動物實驗方案及倫理審查獲廣州中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會批準（編號：20211212008）。

1.2.2 藥物與試劑 竹葉石膏湯，方藥組成：竹葉6 g，生石膏50 g，半夏9 g，麥門冬20 g，人參6 g，粳米10 g，甘草6 g，由廣州中醫藥大學第一附屬醫院提供并經唐洪梅主任中藥師鑒定為正品；秋水仙堿片（批準文號：國藥準字H20113208）購于廣東彼迪藥業有限公司；戊巴比妥鈉（批號：811B025）購于北京索萊寶生物科技有限公司；尿酸鈉溶液（批號：CW2567）購于廣州市信洪貿易有限公司；熒光定量PCR試劑盒（批號：QP002）購于廣州復能基因有限公司；TRIzol試劑（批號：DP424）、cDNA合成試劑盒（批號：KR202-02）購于北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 主要儀器 ST16型離心機（美國Thermo Fisher公司）；SpectraMax iD5型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；Veriti Dx型熱循環儀（上海艾研生物科技有限公司）；StepOneTM熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）；K5600型核酸微量分析儀（北京凱奧科技發展有限公司）。

1.2.4 造模與分組 通過簡單隨機分配法將36只大鼠分為空白組、模型組、秋水仙堿組、竹葉石膏湯組，每組9只；GA的急性動物模型參考改良的Coderre法[25]。除空白組外，其他組大鼠在0.3%戊巴比妥鈉麻醉狀態下消毒后，在大鼠右側踝關節腔內注射0.1 mL尿酸鈉溶液（50 mg/mL）；空白組大鼠在相同的條件下注射0.1 mL生理鹽水。造模大鼠踝關節腫脹程度、疼痛水平明顯高于空白組，并出現關節炎的各種癥狀，則提示模型成功[25]。

1.2.5 實驗給藥 造模成功后6 h進行灌胃給藥，按照《中藥藥理研究方法學》大鼠用藥為成人（60 kg體質量）6.3倍進行換算，竹葉石膏湯組大鼠灌胃給予竹葉石膏湯（0.5 g/kg）；秋水仙堿組大鼠灌胃給予秋水仙堿片懸濁液（0.3 mg/kg)；空白組及模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，1次/d，連續給藥14 d。

1.2.6 觀察指標

1.2.6.1 踝關節直徑測量 使用游標卡尺測量并記錄大鼠治療前后右側踝關節直徑。

1.2.6.2 血清尿酸檢測 給藥結束后，0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹正中切開，逐層鈍性分離至腹主動脈清晰可見，采用一次性采血針采血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清，采用血生化儀檢測大鼠血清中尿酸含量。

1.2.6.3 踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達量 取大鼠右踝關節滑膜組織，按TRIzol試劑盒操作方法提前總RNA，隨后利用反轉錄試劑盒擴充，嚴格按試劑盒操作步驟執行，上機進行RT-qPCR反應，條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環。以GAPDH作為內參，2-△△Ct法計算目的基因相對表達情況，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.7 統計學方法 通過SPSS 20.0進行統計學分析，計量資料通過Shapiro-Wilk進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料采用（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差齊采用Bonferroi進行兩兩比較。組內治療前后比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 竹葉石膏湯的主要成分及潛在靶點獲取 篩選出竹葉石膏湯的主要化學成分147種。（見表2）去除重復并通過Uniprot數據庫標準基因名轉換后，共得到584個作用人類的基因靶點。通過GeneCards、OMIM數據庫共檢索到與痛風性關節炎相關基因223個，相匹配映射得到竹葉石膏湯治療痛風性關節炎靶點共40個。（見圖1）

圖1 竹葉石膏湯靶點與痛風性關節炎靶點匹配韋恩圖

表2 竹葉石膏湯中部分活性化合物基本信息

2.2 構建藥物-化合物-靶點網絡 利用Cytoscape 3.7.1，構建竹葉石膏湯中藥物-活性化合物-靶點網絡。網絡包含737節點，其中藥物節點7個、活性化合物節點147個和靶點節點584個，2 485條邊。圖中不同顏色及形狀代表不同含義：淺藍色四邊形代表竹葉石膏湯，彩色六邊形代表活性化合物，紫色菱形代表靶點基因。網絡中的每條邊代表藥物所含有的活性化合物及活性化合物與靶點基因之間的相互作用關系。（見圖2）

圖2 “竹葉石膏湯-活性成分-靶點”網絡圖

2.3 “竹葉石膏湯-活性成分-基因靶點-疾病”網絡構建 通過Cytoscape軟件，把上述獲得的竹葉石膏湯活性成分、靶點基因、疾病導進軟件中，進一步構建“竹葉石膏湯-活性成分-靶點基因-疾病”可視化網絡。（見圖3）

圖3 “竹葉石膏湯-活性成分-靶點基因-疾病”網絡圖

2.4 PPI及Hub蛋白確定 利用String在線數據庫，把痛風性關節炎相關靶點基因導入其中，將未連接的靶點隱藏，進一步獲得PPI網絡（見圖4）。通過“Network Analyzer”工具，進一步計算得出各作用靶標的連接度。連接度最高的5個靶標分別為白細胞介素受體相關激酶4（IRAK4）、白細胞介素-6（IL-6）、CXC基序趨化因子配體8（CXCL8）、CC基序趨化因子配體2（CCL2）、白細胞介素-10（IL-10）。（見圖5）由此可知，上述5個靶標在竹葉石膏湯治療痛風性關節炎中發揮了重要作用，為潛在核心靶標。進一步證實了竹葉石膏湯治療痛風性關節炎是通過作用于多個靶標而發揮多種效果。

圖4 蛋白相互作用PPI 網絡

圖5 中藥-疾病核心靶標的條圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析結果顯示，竹葉石膏湯治療痛風性關節炎的核心基因的BP功能主要包括炎癥反應的調節、細胞對脂多糖的反應、細胞對細菌來源分子的反應等，CC的靶點主要富集在細胞質囊泡腔、囊泡腔、質膜筏等，MF功能主要涉及細胞因子活性、細胞因子受體結合、受體配體活性等。（見圖6）

圖6 GO 功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析 竹葉石膏湯治療痛風性關節炎核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、類風濕關節炎信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路等。（見圖7）

圖7 KEGG 通路富集分析氣泡圖（前20 的通路）

2.7 各組大鼠踝關節直徑比較 治療前，模型組、秋水仙堿組及竹葉石膏湯組大鼠踝關節直徑明顯大于空白組（P＜0.05），表明痛風性關節炎模型造模成功。治療后，模型組大鼠踝關節直徑與治療前比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；秋水仙堿組及竹葉石膏湯組大鼠踝關節直徑明顯小于治療前（P＜0.05）；治療后，秋水仙堿組和竹葉石膏湯組大鼠踝關節直徑明顯小于模型組（P＜0.05）。表明秋水仙堿及竹葉石膏湯均可緩解GA大鼠關節腫脹程度。（見表3）

表3 各組大鼠踝關節直徑比較 （±s，cm）

表3 各組大鼠踝關節直徑比較 （±s，cm）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

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2.8 各組大鼠血清尿酸含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清尿酸含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組和竹葉石膏湯組大鼠血清尿酸含量均明顯降低（P＜0.05），且竹葉石膏湯組大鼠血清尿酸含量低于秋水仙堿組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠血清尿酸比較 （±s，μmol/L）

表4 各組大鼠血清尿酸比較 （±s，μmol/L）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與秋水仙堿組比較，cP＜0.05。

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2.9 各組大鼠踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達量比較 與空白組比較，模型組大鼠踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組和竹葉石膏湯組大鼠踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.05），且竹葉石膏湯組大鼠踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA相對表達量低于秋水仙堿組（P＜0.05），而竹葉石膏湯組大鼠踝關節滑膜組織中IL-6 mRNA相對表達量與秋水仙堿組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA 相對表達量比較 （±s）

表5 各組大鼠踝關節滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA 相對表達量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與秋水仙堿組比較，cP＜0.05。

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3 討論

隨著生活水平的提高，且大眾的運動時間逐漸減少，GA的發病率逐年升高。然而，GA治療尚未達成共識，本研究基于生物信息學分析挖掘探索竹葉石膏湯治療GA的潛在有效活性成分、分子靶點及作用機制，發現竹葉石膏湯治療GA的潛在作用機制是“多成分-多靶點-多途徑”的。同時本研究進一步通過動物實驗驗證竹葉石膏湯可以有效緩解GA大鼠踝關節腫脹，降低血清尿酸含量，并能抑制IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表達，為竹葉石膏湯治療GA提供了理論依據。

本研究通過構建竹葉石膏湯-活性成分-靶點網絡，并進行網絡拓撲學分析發現，竹葉石膏湯治療GA的潛在活性成分主要包括豆甾醇、山奈酚和維生素C等。FERRAZ-FILHA Z S等[26]研究發現，豆甾醇能夠通過抑制肝臟黃嘌呤氧化酶的活性來降低高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平，并能明顯降低尿酸單鈉鹽結晶引起的足部水腫，具有明顯的抗氧化活性。MISRA A等[27]發現山奈酚與秋水仙堿均具有抗痛風活性，能抑制MSU激活NLRP3炎癥小體，從而抑制IL-1β釋放。此外，維生素C作為抗氧化劑可抑制TXNIP蛋白激活，從而減輕MSU引起的GA[28-29]。因此，竹葉石膏湯中的有效活性成分可能通過降低血清尿酸水平，并抑制NF-κB途徑減少炎癥細胞因子的產生，從而發揮減緩GA進展的協同作用。

本研究通過將竹葉石膏湯靶點與GA的差異表達基因進行相互映射得出40個潛在分子靶點，進一步利用Cytoscape軟件中的Cytohubba、BisoGenet及CytoNCA插件得出竹葉石膏湯治療GA的潛在治療靶點。潛在靶點分別是IL-6、CXCL8、CCL2、IRAK4、IL-10。研究[30-31]發現，IL-6在GA患者關節滑膜及血清中表達升高，并能參與多種疾病的炎癥反應，可促進IL-1β及TNF-α等炎癥因子釋放，從而加速GA病變過程。SO A K等[32]研究發現，CXCL8是一種巨噬細胞分泌的趨化因子，主要作用于中性粒細胞募集與活化，從而激活炎癥反應的發生。GRAINGER R等[33]研究發現，高尿酸血癥患者血清CCL2水平升高，從而導致循環中CD14+單核細胞增加，而CD14+單核細胞是GA發作期間最早遷移到炎癥部位的白細胞之一。研究發現，IL-10可作為抗炎因子抑制MSU誘導的巨噬細胞源性TNF-α和炎癥蛋白（MIP-1α和MIP-1β）的表達[34]。痛風發作時，Toll樣受體4會被尿酸鹽結晶激活，進一步逐漸活化下游的各級激酶，如IRAK4等進行自身的磷酸化，最終活化核轉錄因子-κB，釋放IL-6等炎癥細胞因子，誘導炎癥反應的發生[34]。本研究通過實驗動物驗證了竹葉石膏湯可以有效抑制GA大鼠滑膜組織IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表達，減緩GA大鼠踝關節腫脹，降低GA大鼠血清尿酸。

本研究靶基因KEGG富集分析結果提示，炎癥反應的調節、細胞對脂多糖、細菌侵襲及生物刺激的反應、IL-17信號通路和TNF信號通路等可能是竹葉石膏湯治療GA的潛在作用途徑。研究[36-37]表明，GA是由先天免疫系統激活驅動的典型炎癥性疾病，是MSU誘導的炎癥反應引起的，主要由巨噬細胞和中性粒細胞介導，特別是NLRP3炎癥小體的激活，從而導致IL-1β和其他炎癥細胞因子的釋放。因此，調節炎癥反應是治療GA的關鍵。另外，RAUCCI F等[38]研究發現IL-17可能在MSU誘發的急性GA晚期階段起關鍵作用。此外，MSU可介導炎癥因子的釋放，激活NF-κB啟動和調節TNF-α與炎性免疫反應有關的炎癥介質、黏附分子等相關基因的表達，從而加速GA的炎癥反應。同時，竹葉石膏湯中的有效活性成分具有降低血清尿酸水平、減少MSU堆積的作用，并能抑制NF-κB途徑減少炎癥細胞因子的產生，因此，推測竹葉石膏湯能發揮抑制尿酸鹽結晶形成、抗炎等作用機理起到治療或延緩GA病變過程。秋水仙堿能通過降低白細胞活動、吞噬作用及減少乳酸形成，從而減少尿酸結晶的沉積，減輕炎癥反應，發揮止痛作用[39-40]。因此，本研究選擇秋水仙堿作為陽性對照藥物。本研究仍然存在局限性：（1）本研究GA動物模型僅挑選核心靶點IRAK4及IL-6進行驗證，其他核心靶點及通路有待進一步研究；（2）竹葉石膏湯有效成分復雜，具體何種成分起到治療GA的關鍵，有待進一步實驗探討。

綜上所述，竹葉石膏湯可通過“多成分-多靶點-多途徑”有效抑制GA大鼠滑膜組織IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表達，減緩踝關節腫脹，降低血清尿酸，從而發揮對GA的治療作用。