電子束輻照對藏藥三味檀香湯散質量及滅菌效果的影響*

戈雅倩，謝和兵,4，尼瑪次仁，白瑪旦增

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3.江蘇神猴醫藥研究有限公司，江蘇 南通 226133；4.西藏神猴藥業有限責任公司，西藏 日喀則 857000）

三味檀香湯散，藏藥名為贊旦松湯，記載于《四部醫典》和《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥：第一冊》[1-2]。三味檀香湯散由檀香、肉豆蔻、廣棗組成，是藏醫治療心熱病的常用驗方，具有清熱、寧心、安神的功效，可用于治療“寧彩”病及心臟病引起的心慌、胸悶、氣促、口干舌燥、目赤、胸背疼痛、心前區灼痛等，臨床療效顯著。研究表明其治療心血管疾病具有較好療效[3-8]。三味檀香湯散采用傳統的藏藥散劑生產工藝，將藥材生藥粉碎后直接入藥，存在微生物無法控制的不足。目前藏藥生產企業常用的濕熱、干熱滅菌方式，會導致檀香、肉豆蔻藥材中的揮發性活性成分損失，影響療效，不適用于本品的滅菌。本研究將電子束輻照用于藏藥的滅菌工藝，對自制三味檀香湯散進行不同劑量的電子束輻照，通過比較輻照前后三味檀香湯散的性狀、顯微特征、指紋圖譜、有效成分含量變化及其微生物含量變化，考察電子束輻照技術對藏藥三味檀香湯散主要有效成分和滅菌效果的影響，旨在為藏藥三味檀香湯散的滅菌方法提供實驗依據，并為含生藥材及揮發性藥材的中藥制劑的滅菌提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器 Essentia LC-16型高效液相色譜儀（配有SPD-16紫外檢測器）、UV-1900i型紫外分光光度計（日本島津公司）；XSR205DU/AC型十萬分之一天平（美國梅特勒托利多科技有限公司）；WMS-1037型生物光學顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）；UC-250DE型超聲清洗儀（上海精其儀器有限公司）；TGL-16B型臺式高速離心機（常州中捷實驗儀器制造有限公司）；DZ-10/20型電子直線加速器（安徽戈瑞電子科技股份有限公司）。

1.2 藥物與試劑 去氫二異丁香酚對照品（批號：17838-201804，純度：98.6%）、沒食子酸對照品（批號：110831-201906，純度：91.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（批號：20220221，色譜純）、磷酸（批號：20220321，優級純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水；肉豆蔻（批號：210501）、檀香（批號：210801）藥材均購自安徽援康中藥飲片股份有限公司；廣棗（批號：20200301）購自西藏神猴藥業有限責任公司。肉豆蔻、檀香、廣棗經江蘇神猴醫藥研究有限公司研發部檢測為正品，符合2020年版《中華人民共和國藥典）》標準。

2 方法與結果

2.1 樣本制備與輻照處理 分別取廣棗、肉豆蔻、檀香藥材粉碎，過二號篩，少量多次等比例混合均勻，分裝于鋁箔袋密封儲存，12 g/袋，即得自制三味檀香湯散樣品。所有樣品均由中廣核戈瑞科技有限公司采用電子束輻照滅菌處理，輻照劑量分別為2、4、6、8、10 kGy。

2.2 性狀比較 通過日光下目視、手觸、鼻嗅、口嘗的方式對三味檀香湯散粉末樣本外觀、色澤、氣味、味道等進行考察。以未輻照樣本即0 kGy樣品為參照，所有粉末呈現棕色，質柔軟，氣香濃烈，味辛辣、微苦。（見圖1）經比較，輻照前后的樣品粉末在外觀、色澤、氣味上無明顯變化。

圖1 樣品性狀圖

2.3 顯微特征 分別取不同輻照劑量下的樣品少量置于載玻片上，滴加甘油醋酸試液，蓋上蓋玻片，置生物光學顯微鏡下觀察，所有樣品均可見大量晶纖維、淀粉粒，臍點明顯，導管碎片、內果皮石細胞清晰可見，內果皮石細胞內含黃棕色物質。（見圖2）說明電子加速器輻照對三味檀香湯散的顯微鑒別無影響。

圖2 樣品顯微特征

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.05%磷酸（A）-甲醇（B），梯度運行程序如下：0~60 min，10%B→100%B；60~65 min，100%B→10%B，65~70 min，10%B；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為270 nm；進樣量為10 μL。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸對照品10.01 mg、去氫二異丁香酚對照品10.02 mg，分別用甲醇溶解于10 mL量瓶中，定容、搖勻，制得質量濃度分別為1.001 mg/mL、1.002 mg/mL的沒食子酸、去氫二異丁香酚對照品儲備液。精密移取沒食子酸對照品儲備液3.0 mL、去氫二異丁香酚對照品儲備液8.0 mL于同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到沒食子酸、去氫二異丁香酚質量濃度分別為0.120、0.321 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取三味檀香湯散約1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL的70%甲醇溶液，稱定質量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，離心5 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.4.4 系統適用性試驗 將提取溶劑、混合對照品溶液、供試品溶液按“2.4.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。（見圖3）提取溶劑作為空白，所得色譜圖在沒食子酸、去氫二異丁香酚保留時間處無干擾峰出現。沒食子酸、去氫二異丁香酚分別與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數按沒食子酸峰和去氫二異丁香酚峰大于3 000計。色譜系統適用性試驗符合含量測定要求。

圖3 HPLC 圖

2.4.5 線性關系考察 精密吸取沒食子酸和去氫二異丁香酚的混合對照品溶液0.10、0.50、1.50、3.00、4.50、6.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配成不同質量濃度的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進行測定。分別以兩種成分的質量濃度（mg/mL）為橫坐標X，色譜峰面積積分值為縱坐標Y，繪制標準曲線并進行回歸分析計算。結果顯示，沒食子酸在0.001 20～0.072 00 mg/mL范圍內與峰面積積分呈良好的線性關系，回歸方程為Y=3.83×107X－1.47×105（r=0.999 9）；去氫二異丁香酚在0.003 20～0.192 00 mg/mL范圍內與峰面積積分呈良好的線性關系，回歸方程為Y=4.02×107X＋1.24×105（r=0.999 9）。（見圖4）

圖4 線性關系圖

2.4.6 精密度試驗 按“2.4.3”項下方法制備均勻供試品溶液。按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6次，測得沒食子酸成分峰面積的RSD（n=6）為0.65%，去氫二異丁香酚峰面積的RSD（n=6）為0.43%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩定性試驗 取三味檀香湯散樣品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，分別在常溫放置0、2、4、9、14、24 h，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，沒食子酸峰面積的RSD（n=6）為1.02%，去氫二異丁香酚峰面積的RSD（n=6）為1.07%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗 取三味檀香湯散樣品，按“2.4.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，測得沒食子酸含量的RSD（n=6）為1.17%，去氫二異丁香酚含量的RSD（n=6）為0.76%，表明方法重復性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 取已知含量的三味檀香湯散樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定。分別精密加入已知含量的混合對照品溶液，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進行測定，計算沒食子酸和去氫二異丁香酚的平均加樣回收率和RSD值。（見表1）

表1 加樣回收率結果 （n=2）

2.4.10 樣品測定 取不同劑量輻照后的三味檀香湯散樣品，按“2.4.3”項制備供試品溶液，按“2.4.1”項進樣分析，記錄色譜圖。外標法計算沒食子酸和去氫二異丁香酚含量，運用SPSS 26.0軟件進行數據處理，兩組間比較采用成組t檢驗。結果顯示，不同劑量輻照后的三味檀香湯散的主要有效成分沒食子酸和去氫二異丁香酚含量與未輻照樣本（0 kGy輻照）比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表2）

表2 樣品的含量測定結果 （n=3）

2.5 指紋圖譜相似度考察 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”對所得色譜圖進行處理，以0 kGy供試品色譜圖為參照，經過多點校正、全譜峰匹配，生成對照圖譜R。（見圖5）樣品相似度結果均≥0.996。（見表3）

表3 樣品指紋圖譜相似度

圖5 樣品的指紋圖譜

2.6 微生物限度檢測 參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則1105微生物計數法、1106控制菌檢查法和1107非無菌藥品微生物限度標準（需氧菌總數≤2×103cfu/g，霉菌、酵母菌總數≤200 cfu/g，控制菌大腸埃希菌不得檢出），對三味檀香湯散樣品粉末的細菌菌落總數、霉菌和酵母菌總數及大腸菌群進行隨機抽樣檢查。（見表4）結果顯示，三味檀香湯散樣品經過輻照后細菌菌落數、霉菌和酵母菌菌落總數均降低（P<0.05），大腸菌群在輻照前后均未檢出；當輻照劑量為4 kGy時，微生物限度已滿足規定標準，當達到6 kGy及以上時微生物均未檢出。

表4 樣本的微生物限度檢測結果 （n=2）

3 討論

3.1 電子束輻照應用于藏藥滅菌的優勢 藏醫藥是祖國傳統醫學璀璨的一脈，更是傳統文化的重要組成部分，傳承發展意義重大，但受高原地區經濟社會發展等因素的制約，藏藥存在劑型單一、質控水平低等不足。傳統藏藥制劑多以生品藥粉直接入藥制成丸劑、散劑[9]，導致產品微生物限度很難符合《中華人民共和國藥典》規定。

電子束輻照滅菌可利用電子加速器產生的高能電子束照射物料達到殺滅微生物的目的[10]。與傳統的鈷-60輻照比較，電子束輻照滅菌具有輻照束流定向、能量利用充分、不產生核廢料、無環境污染等優點。隨著國內電子加速器制造技術的不斷進步，電子束輻照在中藥、醫療器械、食品、衛生材料滅菌領域廣泛使用[11-15]，但對藏藥的輻照滅菌研究較少[16]。此外，電子束輻照滅菌與目前常規使用的濕熱、干熱、紫外線、環氧乙烷滅菌等比較，最大的優勢在于電子束輻照屬于冷滅菌技術，不改變物料的溫度，并且穿透性高，滅菌效率高，尤其適用于含生藥材粉末及揮發性成分較多的藏藥滅菌[17]。

3.2 主要有效成分的選擇 現代藥理研究表明，沒食子酸是廣棗藥材的主要有效成分之一，具有保護心血管、保護神經系統、抗炎、抗氧化等作用[18-22]。去氫二異丁香酚是肉豆蔻藥材的主要有效成分之一，具有較強的抑菌、抗炎、抑制肝內脂質氧化等作用[23-25]。同時，二者也是2020年版《中華人民共和國藥典》規定的藥材含量測定指標成分[26]，因此，本研究選擇去氫二異丁香酚和沒食子酸作為本品的主要有效成分。

3.3 含量測定方法學研究 本研究采用紫外分光光度計進行全波長（190～700 nm）掃描，結果顯示沒食子酸在270 nm處有最大吸收；去氫二異丁香酚在274nm處有最大吸收，在270 nm處也有較大吸收。綜合二者吸收峰走勢與分別在270 nm和274 nm處的吸收值測定結果變化情況，本研究選擇270 nm作為檢測波長。本研究在流動相優選時分別考察了磷酸-甲醇溶液和醋酸-甲醇溶液的分離效果，前者所得樣品峰分離度明顯優于后者，故選擇磷酸-甲醇溶液作為流動相。主要指標成分沒食子酸與去氫二異丁香酚的極性差異較大，采用單一流動相無法將兩者分離，并呈現于同一張色譜圖，故本研究采用梯度洗脫的方式，同時對兩種成分進行定量測定。

3.4 輻照劑量的選擇 本研究遵循2015年國家食品藥品監督管理總局發布的《中藥輻照滅菌技術指導原則》，設置2、4、6、8、10 kGy的輻照劑量梯度，以確保中藥的安全、有效、質量穩定。通過與未輻照樣品比較，當輻照劑量為2 kGy時，微生物含量明顯下降。當輻照劑量為4 kGy時，微生物含量即可滿足《中華人民共和國藥典》標準，殺菌效果顯著，且該劑量對主要有效成分含量無明顯影響，指紋圖譜相似度≥0.996。

4 結論

不同劑量的電子束輻照對藏藥三味檀香湯散的各項指標均無明顯影響，且可明顯降低藥材的微生物水平。輻照劑量為4 kGy時可達到良好的滅菌效果。因此，電子束輻照滅菌是一種有效控制藏藥三味檀香湯散微生物水平的方法，并對藥品質量無明顯的影響。本研究可為藏藥三味檀香湯散的輻照滅菌工藝提供參考，同時也為含有生藥的藏成藥制劑的滅菌提供新思路。此外，本研究建立了高效液相色譜梯度洗脫法同時對三味檀香湯散中的指標成分沒食子酸、去氫二異丁香酚進行定量測定，可用于三味檀香湯散的質量評價，并為本品的質量標準的提升提供參考。