灰色關聯分析結合聚類分析評價不同產地板藍根飲片質量*

龐文娟，張生杰，田志梅

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

板藍根飲片是一種具有廣譜抗病毒活性的中藥[1]，在我國已有上千年的用藥歷史。其來源是十字花科植物菘藍（Isatis indigoticaFort.）的干燥根[2]，屬二年生草本植物，在甘肅張掖地區有大規模的人工種植。在中醫臨床上，板藍根主要用于治療溫熱病初起，長于利咽喉，解溫熱火毒，在治療咽喉腫痛常配伍牛蒡子使用。現代藥理學實驗[3-4]證實，板藍根具有抗病毒、抗菌、免疫調節、抗炎和利膽作用，并能抑制多種病毒引起的疾病。臨床上板藍根主要用于治療咽喉疼痛、感冒、發熱、病毒性肝炎和流行性乙型腦炎[5]。LI Z T等[6]通過臨床試驗全面評估了板藍根治療甲型和乙型流感病毒抗流感感染的有效性和安全性。在近些年公共衛生事件中，板藍根廣泛應用于病毒引起的各種疾病的預防和治療，療效顯著。CHEN Q等[7]通過網絡藥理學的方法研究發現板藍根對新型冠狀病毒感染具有潛在的藥理作用。板藍根抗病毒活性主要取決于水溶性成分，包括氨基酸、核苷、含硫生物堿等。藥理活性主要依賴于其多種成分的協同作用，通過直接殺滅病原病毒或調節免疫系統以增強抗病毒能力[1]。控制好藥材質量是保證臨床療效的重要手段，目前板藍根主要來源是人工種植[8]，建立一種全面、客觀的藥材質量評價方法對保證藥材質量尤為重要。

灰色關聯度分析（grey relation analysis，GRA）是研究多重因素的現代統計分析方法，用關聯度或者相對關聯度來表示研究對象之間的相關性，廣泛應用于經濟、社會、科學研究等各領域[9]。在中藥的質量控制、中藥生產中關鍵工藝參數篩選、譜效關系研究方面灰色關聯分析已有應用[10-14]。為了客觀有效地評價板藍根飲片的質量，本研究根據2020年版《中華人民共和國藥典》標準，測定板藍根飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、（R、S）-告依春（C5H7NOS）的含量，并用層次分析法（AHP）確定指標的權重，旨在建立灰色關聯分析和聚類分析板藍根飲片質量評價模型。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260Ⅱ高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；UN110恒溫烘箱（美墨爾特）；MS205D十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；F0410箱式電阻爐（重慶雅馬拓科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑（R，S）-告依春（C5H7NOS）（批號：111753-202007，含量：100.0%）購于中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇（批號：10951807816）購于德國Merck公司；色譜純磷酸（批號：J2111704）購于阿拉丁；其他試劑均為分析純。

40批板藍根飲片來自市場抽檢，分別抽檢中藥飲片生產企業20批，藥品經營企業10批，使用單位10批。（見表1）40批樣品均經武威市藥品檢驗檢測中心副主任中藥師張生杰鑒定為板藍根飲片。

表1 40 批板藍根飲片樣品來源

2 方法與結果

2.1 板藍根飲片各指標性成分測定 按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部板藍根飲片標準[含量測定]項下色譜條件[1]，測定板藍根飲片中（R，S）-告依春（C5H7NOS）含量。色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.02%磷酸溶液（7∶93）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為245 nm；進樣量為20 μL。按照2020年版《中華人民共和國藥典》四部（通則0832第二法）測定水分，照通則2302測定總灰分和酸不溶性灰分，按照通則2201項下醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定浸出物[15]，結果見表2。

表2 不同批次板藍根飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、告依春的含量

2.2 指標權重的確定 在利用多個評價指標進行綜合評判時，各指標在整體中貢獻和重要程度不同，不考慮量化指標權重的大小，簡單認為所有的評價指標的貢獻程度相同，這在實際評價中缺乏合理性，因此在利用多個綜合指標評價時，確定指標權重能更真實、客觀體現事物本質特性[16]。計算權重常用的方法有7種，不同計算方法的區別主要是應用原理不相同，在實際應用過程中，要結合具體問題選擇適合的計算方法[17]。藥品質量評價多采用層次分析法來計算指標權重。本研究同樣采用層次分析法計算權重，根據指標對板藍根質量貢獻大小，對指標進行賦值（1.同等重要；3.A比B稍微重要；5.A比B明顯重要；7.A比B強烈重要；9.A比B極端重要）：（R，S）-告依春（7）、浸出物（5）、總灰分（3）、酸不溶性灰分（3）、水分（1），并計算指標權重Wj。5個評價指標的權重Wj分別為：（R，S）-告依春（0.368）、浸出物（0.263）、總灰分（0.158）、酸不溶性灰分（0.158）、水分（0.053）。

2.3 板藍根飲片質量灰色關聯分析

2.3.1 參考序列的選擇 設有n個檢驗樣品，且每個樣品有m個評價指標，組成一個評價序列{Xik}（i=1，2，3，...，n；k=1，2，3，...，m）（本研究中n=40，m=5）。取負向評價指標水分、酸不溶性灰分、總灰分倒數作為評價指標，與浸出物和（R，S）-告依春含量共同構成指標矩陣。

2.3.2 確定參考數據列 設各指標的最大值構成最優參考數據列，記作{Xsk}，Xsk=x′0（1），x′0（2），...，x′0（m）；各指標的最小值構成最差參考數據列，記作{Xtk}，Xtk=x′0（1），x′0（2），...，x′0（m）。

2.3.3 對指標數據進行無量綱化 在實際分析中，分析數據很難完全表征事件本身特征，且表示物理意義也不同，如果不對數據進行無量綱化處理，就很難得到正確的分析結論。通常數據無量綱化處理，多使用標準化、均值化、標準方差法以消除彼此之間的影響。本研究用均值化對測量數據進行無量綱化處理，計算方法見公式[1]。

式中xi（k）為量綱化處理后的數據，x′i（k）表示原始數據。

2.3.4 計算關聯系數 根據公式[2]計算分析對象對應最佳參考序列的關聯系數，根據公式[3]計算分析對象對應最差參考序列的關聯系數。其中ρ為分辨系數，表示關聯系數之間的差異，ρ取值在0到1之間，當ρ越小時，表示差異越顯著，分辨率越高。一般用ρ=0.5計算關聯系數，這樣可簡化計算過程，同時也能滿足分辨率[18]。

2.3.5 關聯度及相對關聯度 因指標彼此間的物理意義、表征特征屬性不同，所以在分析時引入了樣品評價指標權重Wj，來體現各指標不同的貢獻。按公式[4]計算相對于最佳參考序列的關聯度，按公式[5]計算相對于最差參考序列的關聯度，按公式[6]計算板藍根飲片的相對關聯度rj，根據相對關聯度的大小，按大到小依次排序，結果見表3。

表3 評價單元序列相對于最優參考序列的關聯系數、關聯度、相對關聯度及排序

2.3.6 結果 通過對40批不同來源板藍根飲片質量指標進行灰色關聯度分析，確定指標權重（R，S）-告依春（0.368）、浸出物（0.263）、總灰分（0.158）、酸不溶性灰分（0.158）、水分（0.053），確定參考數據列，對指標數據進行無量綱化，計算關聯系數，并對相關系數關聯度進行排序，發現37批板藍根飲片相對關聯度介于0.387～0.499，表明板藍根飲片質量總體穩定，相對關聯度大于0.500的樣品有3批（S28、S29、S31），表明這3批板藍根飲片質量明顯優于其他。通過相對關聯度排序可知，S28板藍根飲片樣品質量最好，S22質量最差。

2.4 聚類分析 以5個質量指標關聯系數為變量，研究40批板藍根飲片樣品的質量，構成40個樣本×5階關聯系數矩陣，采用統計軟件SPSS Statistics 20.0進行聚類分析。樣本聚類分析采用組間連接法，以歐幾里得平方距離為區間，當分類距離為5時，40批板藍根飲片樣品分成3類，S28為一類，即第1類，S13、S29、S31歸為第2類，其余36批歸為第3類。從聚類分析結果和表3灰色關聯分析方法結果來看，S28樣品質量最優，并遠好于其他樣品單獨歸為一類，并在灰色關聯分析排序為第1位；S31、S29、S13樣品在灰色關聯分析排序分別為2、3、6位，表明此類樣品質量相近，排序靠前質量較好，其余36批樣品歸為第3類，表明市場上銷售的絕大數的板藍根飲片質量相近、質量穩定。（見圖1）

圖1 40 批板藍根聚類分析樹狀圖

3 討論

中藥化學成分非常復雜，含有多種類型的已知或未知成分，很難具體確定那一種是發揮藥效作用的成分。中藥發揮藥效作用的特點就是各成分協同參與、多途徑、多靶點發揮藥理活性[19]。若從簡單的幾種化學成分含量多少來評價中藥質量，這就違背傳統中醫理論體系[20]。因此，建立一種不同物理意義的多種指標同時評價中藥質量，對中藥的應用和開發具有重要意義。基于灰色關聯度分析模型在模糊系統研究中的優勢，根據傳統經驗對評價指標進行打分，由層次分析法確定的指標權重能客觀反映其內在品質。從分析結果來看，92.5%的板藍根飲片相對關聯度在0.387~0.499之間，只有S28、S29和S31板藍根飲片相對關聯度在0.500以上，表明這3批板藍根飲片的質量明顯優于其他批次。表明市場上銷售的板藍根飲片質量相對穩定，客觀上反映了市售板藍根飲片大部分來自人工種植。相對關聯度排序顯示，編號S28質量最好，其（R，S）-告依春和浸出物的含量最高。這從質量研究的角度證實了浸出物、活性成分含量越高，質量越好的結論[21-22]。

為進一步澄清相對關聯度在0.387~0.499之間的板藍根飲片質量是否存在差異，本研究對40批板藍根飲片樣品的質量進行了聚類分析。聚類分析法是研究分類的統計學方法，具體方法是通過計算樣本之間的距離，將距離接近的歸為一類，不斷計算類與類之間的距離，直到歸一類為止[23]。當類間距為5時，40批板藍根飲片分為3類，僅S28為第1類，S13、S29和S31為第2類，其余36批為第3類。結合灰色關聯度的分析結果，樣品S28相對關聯度排第1位，說明S28的質量明顯優于其他樣品。S13、S29和S31排序同樣位居前列并歸為一類，表明其質量較好并接近。第3類相對關聯度在0.387~0.499之間，占樣品總量90%，說明板藍根飲片質量相對穩定。兩種不同的分析方法共同證明了一個結論，相互印證，證實了灰色關聯分析的準確性。

本研究建立的灰色關聯分析綜合評價模型與聚類分析相結合，適用于多指標的中藥質量綜合評價，方法簡單直觀。同時，也為其他中藥的質量評價提供了新的思路和方法。