LC-AFS法測定朱砂中二價汞的含量

賴利平，楊躍龍

（1.湖南食品藥品職業學院，湖南 長沙 410000；2.懷化市食品藥品檢驗所，湖南 懷化 418000）

朱砂是一味常用的中藥材，具有清心鎮驚、安神、明目、解毒之功效，用于心悸易驚，失眠多夢，癲癇發作，小兒驚風，視物昏花，口瘡，喉痹，瘡瘍腫毒[1-2]。朱砂主要化學成分為天然硫化汞（HgS），其難溶于水，難被人體吸收[3]?，F代醫學研究[4-5]表明，朱砂中含有的少量可溶性汞（Hg2+）能在胃腸道內溶解，是朱砂產生毒理作用的主要活性成分。2020年版《中華人民共和國藥典》標準中采用液相色譜-電感耦合等離子體質譜（LC-ICP-MS）法測定朱砂中的二價汞，但LC-ICP-MS主要依靠進口，成本高，運行費用也高，不便于普及使用。因此，使用成本更低的更易普及的液相色譜-原子熒光光譜（LC-AFS）法測定朱砂二價汞的含量尤為必要，而且使用LC-AFS法測定朱砂二價汞的含量均能滿足2020年版《中華人民共和國藥典》標準的要求?，F將實驗報告如下。

1 儀器與試藥

LC-AFS6500液相色譜原子熒光聯用儀（北京海光公司，貨號：216053）；AB135-S型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司，貨號：1125170265）；LC-ICP-MS（賽默飛世爾公司，貨號：SN02456R）。

汞元素標準溶液（北京海岸鴻蒙標準物質技術有限公司，供含量測定用，批號：A4Q1，濃度：1 000 μg/mL）；甲醇為分析純（美國GRACE公司，批號：2011171）；鹽酸為優級純（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20210825）；乙酸銨為分析純（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20201123）；氫氧化鉀為優級純（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：20190314）；硼氫化鉀為優級純（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20210422）；L-半胱氨酸為生物試劑（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20210308）；胃蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司，批號：A05GS144235）；胰蛋白酶（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：GT003251）；水為超純水由科室自制；朱砂（懷化龍源中藥飲片公司，批號：130402，130611，130826）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 儀器：LC-AFS6500液相色譜原子熒光聯用儀，色譜柱：Angel C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流動相∶甲醇-0.04 mol/L乙酸銨（含0.1%L-半胱氨酸）（3∶97）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；載氣：氬氣，載氣流量：500 mL/min，屏蔽氣流量：1 000 mL/min；載液：鹽酸溶液（1+9），還原劑：2 g/L硼氫化鉀溶液。檢測器：汞燈（主電流30 mA）；負高壓：340 V；進樣量：100 μL

2.2 供試品溶液的制備[6-8]精密稱取本品粉末30 mg（過五號篩），置250mL塑料量瓶中，一式兩份，一份加人工胃液200mL，另一份加人工腸液，搖勻，置37℃水浴中超聲處理2h（每隔15min充分搖勻1次），放冷，分別用相應溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量至50 mL塑料離心管中，靜置24 h，用洗耳球輕輕吹去上層表面溶液，吸取中層溶液15 mL，用微孔濾膜（10 μm）濾過，精密量取續濾液2 mL，置10 mL塑料量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

2.3 對照品貯備液的制備 精密量取汞元素標準溶液1 mL，置100 mL塑料量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1 mL至量瓶中，加流動相稀釋至刻度搖勻，即得。

2.4 線性關系考察 精密量取對照品貯備液0.5、1、5、10、20、50 mL分別至100 mL塑料量瓶中加8%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密量取上述對照品溶液100 μL注入液相色譜原子熒光聯用儀，記錄色譜圖（見圖1）。以濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線。得汞的回歸方程：Y=310.431X+11.832 6（r=0.999 8）；表明汞對照品在質量濃度為0.5～50.0 ng/mL范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好。

圖1 汞對照品溶液圖譜

2.5 加樣回收率試驗

2.5.1 人工胃液回收率試驗 分別精密量取9份已知含量的樣品（批號：130402）約30 mg置250 mL塑料量瓶中，平均分成3組，分別各加入對照品溶液（12.5 μg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2”項下方法制備。分別吸取100 μL注入液相色譜原子熒光聯用儀，按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖（見圖2），計算平均加樣回收率，結果見表1。

表1 人工胃液提取加樣回收率試驗

圖2 人工胃液提取樣品溶液圖譜

2.5.2 人工腸液回收率試驗 分別精密量取9份已知含量的樣品（批號：130402）約30 mg置250 mL塑料量瓶中，平均分成3組，分別各加入對照品溶液（5 μg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2”項下方法制備。分別吸取100 μL注入液相色譜原子熒光聯用儀，按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖（見圖3），計算平均加樣回收率，結果見表2。

表2 人工腸液提取加樣回收率試驗

圖3 人工腸液提取樣品溶液圖譜

試驗結果表明，該方法準確度良好。

2.6 精密度試驗 取同一批朱砂樣品（批號：130402），按樣品含量測定方法配制1份，連續進樣6次，進樣量為100 μL，記錄峰面積，結果汞的峰面積RSD為3.5%。試驗結果表明：儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取同一批朱砂樣品（批號：130402），按樣品含量測定方法配制1份，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣100 μL，記錄峰面積，結果汞的峰面積RSD為3.6%。試驗結果表明：本品溶液在放置24 h后測定，汞的峰面積基本無變化，表明溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性試驗 取同一批朱砂樣品（批號為：130402），按樣品含量測定方法配制6份，按照“2.1”項下色譜條件測定，分別進樣100 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。按回歸方程計算汞的含量，結果RSD分別為4.0%。試驗結果表明：該方法重復性良好。

2.9 陰性對照品干擾試驗 按“2.2”項下方法制備不含朱砂的陰性對照品溶液。進樣量為100 μL，注入液相色譜原子熒光聯用儀，記錄色譜圖。試驗結果表明：陰性對照品溶液不干擾測定。（見圖4~5）

圖4 人工胃液提取空白樣品溶液圖譜

圖5 人工腸液提取空白樣品溶液圖譜

2.10 樣品含量測定 取3批不同批號的樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果見表3。

表3 樣品中二價汞的含量測定結果

3 討論

雖然HPLC-ICP-MS聯用技術是目前元素形態分析研究中最常用的方法[9-12]，但其在實際應用中還存在著較多不足之處。如HPLC法多采用有機溶劑和無機鹽為流動相，會造成ICP-MS進樣管和采樣錐的堵塞、基體效應嚴重、影響檢測靈敏度、儀器運行成本高等問題。通常在實際應用中可沖入5%（體積分數）以下的氧氣來解決碳沉積導致的錐孔堵塞問題，但這會造成采樣錐使用壽命的縮短。因此，在實際應用過程中還需要根據不同實驗條件和實驗目的來選取不同的方法[13-15]，彌補聯用技術存在的缺陷。LC-AFS是中國具有自主知識產權的分析儀器，具有分析靈敏度高、線性范圍寬、光譜干擾及化學干擾少、儀器結構簡單、成本低廉易于維護等特點[16-17]，As、Hg、Se、Sb等元素的主要熒光譜線介于200～290 nm之間，正好是日盲光電倍增管靈敏度最好波段，即處于AFS最佳檢測波長范圍內。另一方面這些元素可以形成氣態化合物，與大量的基體相分離，從而大大降低了基體干擾，而且與LC-ICP-MS的溶液直接噴霧進樣相比，AFS的蒸汽發生技術能將待測元素充分預富集，進樣效率近乎100%。LC-AFS法其最大特點在于對含有特定元素的化合物具有高度的專一性和較高靈敏度[18]。由“2.10”項可以看出LC-AFS法具有與LC-ICP-MS相似的分析性能，與LC-ICP-MS相比較，LC-AFS法在采購成本、使用成本具有極大優勢，并且具有操作簡單、容易上手的特點。

LC-AFS法測定朱砂中的二價汞的原理就是利用C18柱將其進行分離，分離后的二價汞在酸性條件下，無機汞與硼氫化鉀在線反應生成汞蒸氣，由原子熒光光譜儀測定。

3.1 流動相的選擇 實驗中通過使用不同濃度的乙酸銨和L-半胱氨酸進行比較，發現在使用0.04 mmol/L乙酸銨和0.1%L-半胱氨酸時二價汞的峰型較好，出峰時間較快。所以最終選擇甲醇-0.04 mol/L乙酸銨（含0.1%L-半胱氨酸）（3∶97）為流動相。

3.2 還原劑濃度選擇[19-20]硼氫化鉀是原子熒光光譜儀常用的還原劑，其作用是將待測樣品溶液中的鹽酸與還原劑反應，生成的氫氣和溶液中的汞元素形成氫化物，然后借助于載氣將其導入石英管燃燒，氫化物即迅速原子化。還原劑濃度過高，生成的大量氫氣會使儀器對汞的靈敏度和穩定性變差，因此，在本試驗中分別嘗試采用0.1%、0.2%、0.3%的硼氫化鉀進行試驗，使用0.2%的硼氫化鉀做還原劑時二價汞的靈敏度和穩定性最佳，故采用0.2%的硼氫化鉀作為還原劑。

3.3 稀釋溶劑選擇 將水、流動相分別作為稀釋溶劑分別進樣進行比較。結果在本試驗所采用的色譜條件下，用流動相作為稀釋溶劑峰形較好，故采用流動相作為稀釋溶劑。

3.4 結論 本法通過模擬人體胃腸道環境對朱砂中的可溶性汞進行提取，將提取液進行稀釋后進入LC-AFS進行測定，通過對實驗條件的不斷摸索，多次優化設計，使得該方法操作簡便，靈敏度高，重現性好，穩定可靠，符合2020年版《中華人民共和國藥典》9101分析方法指導原則要求，可用于朱砂中二價汞的的含量測定。