基于網絡藥理學與分子對接技術探討玉屏風散防治上呼吸道感染的潛在機制*

俞 月，何清湖,2，李 玲，邱麗婷，鄺 敏，姚昆鵬

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南醫藥學院，湖南 懷化 418000）

上呼吸道感染實質上為鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱，狹義的上呼吸道感染俗稱“感冒”“傷風”[1]。上呼吸道感染約占所有呼吸道感染的87.5%，其發病主要涉及鼻、咽、喉等部位，表現為噴嚏、鼻塞、流鼻涕、咽喉腫痛等，嚴重影響患者的生活質量[2]。目前的治療方案多采用抗菌藥物、抗病毒藥物、鎮咳藥物、解熱鎮痛抗炎藥物等[3]。然而，有部分人群容易反復罹患上呼吸道感染，或患病后遷延難愈，為現代醫學的一大難題。中醫學認為，此類“傷風”“感冒”患者多有“肺氣不足”之征象，選用補益肺脾的方劑對防治上呼吸道感染有一定作用[4-5]。研究[6-7]表明，玉屏風散能夠調節反復上呼吸道感染患者的機體免疫功能，減少復發次數，縮短病程，且無明顯不良反應，但其具體效應機制并不明晰。故本研究采用網絡藥理學與分子對接技術，探討玉屏風散防治上呼吸道感染的潛在機制，以期為臨床用藥提供一定借鑒，并促進玉屏風散的現代藥理學研究。

1 資料與方法

1.1 玉屏風散活性成分、作用靶點獲取及中藥歸經可視化 通過TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數據庫分別以黃芪、白術、防風為關鍵詞檢索玉屏風散的活性成分。篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18。將有效成分導入TCMSP數據庫獲取有效成分的作用靶點，將上述靶點導入UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/），獲取靶點對應的基因名。利用TCMIP數據平臺、2020年版《中華人民共和國藥典》收集并分析中藥歸經信息，檢索中國知網數據庫查閱相關文獻確定中藥歸經，通過Cytoscape3.7.1軟件構建玉屏風散歸經網絡圖，依據連接度值（Degree）大小對歸經網絡的各臟腑重要度進行排序，列出連接Degree值，分析玉屏風散對經絡的選擇性。

1.2 上呼吸道感染的疾病靶點檢索及“活性成分-作用靶點-疾病”作用網絡構建 通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）數據庫，獲取上呼吸道感染的疾病靶點。為明確玉屏風散與上呼吸道感染靶點間的相互作用，使用TBtools軟件將活性成分的作用靶點與疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖。將交集靶點導入STRING（https://STRING-db.org），最低互動得分設置為0.9，去除游離節點，得到蛋白質-蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction net-work，PPI）。將PPI導入Cytoscape 3.8.0軟件，采用Network analyzer計算Degree值，構建“活性成分-作用靶點-疾病”作用網絡模型，明確其有效成分。將交集基因導入Cytoscape 3.8.0，利用其內置的CytoNCA插件，進行拓撲分析后，篩選介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、借助度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method，LAC）和網絡中心性（network centrality，NC），對靶標進行篩選，選擇大于所有指標中位數的基因進行后續分析。結合BioGPS數據庫進行組織特異性表達篩選，明確拓撲分析后的基因所屬組織特異性，剔除非特異性靶標，得到關鍵靶點。

1.3 功能和通路富集分析 取PPI中的靶點，利用R語言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview等相關程序包對交集基因進行基因本體功能富集（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics，KEGG）富集分析。GO分析選擇生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）3個部分進行，通路分析選擇KEGG，并繪制相關條形圖和氣泡圖。

1.4 分子對接 選擇“活性成分-作用靶點-疾病”作用網絡模型中度值排名前10的活性化合物作為配體，取拓撲分析結合組織特異性表達篩選后的關鍵靶點作為受體，進行分子對接。通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載中藥成分的SDF文件，在PDB數據庫（http://www1.rcsb.org/）下載核心靶點相關蛋白的2D結構，利用PyMOL 2.4.0軟件去除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子）。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對晶體結構進行加氫處理，并計算蛋白質電荷，所有配體和受體文件均保存為pdb格式。使用Autodock Vina 1.1.2軟件進行分子對接，計算最低結合能，使用PyMol 2.4.0軟件進行可視化。

2 結果

2.1 玉屏風散活性成分、作用靶點及中藥歸經可視化 通過TCMSP數據庫，獲取玉屏風散的活性成分45種，其中黃芪20種，防風18種，白術7種。根據活性成分進行作用靶點篩選，刪除冗余和無靶點的成分，最終得到活性成分38種，對應靶點193個。（見表1）根據TCMIP數據平臺、2020年版《中華人民共和國國藥典》、中國知網獲取玉屏風散中藥的歸經信息，構建中藥-歸經網絡圖。（見圖1）依據連接度值排序，發現網絡連接度值最高的經絡為脾經，度值為3；其余依次為肺經、膀胱經、胃經、肝經，度值均為1。結果表明，玉屏風散對機體脾經、肺經、膀胱經等經絡選擇性較高，其主要通過干預上述經絡到達病位發揮治療作用。（見表2）

圖1 玉屏風散中藥-歸經網絡圖

表1 玉屏風散的部分有效成分信息

表2 玉屏風散中藥-歸經表

2.2 上呼吸道感染的疾病靶點及“活性成分-作用靶點-疾病”作用網絡 通過GeneCards、OMIM、PharmGkb檢索上呼吸道感染的疾病靶點，依次得到7 694、118、611個靶點。刪除重復后，得到疾病靶點7 914個。再經UniProt數據庫進行轉化，將玉屏風散活性成分對應的193個靶點與上呼吸道感染7 914個靶點取交集，得到170個潛在靶標。（見圖2）將潛在靶標上傳到STRING平臺，得到PPI網絡。將數據導入Cytoscape 3.8.0進行可視化。（見圖3）采用Cytoscape 3.8.0軟件進行分析，構建“活性成分-作用靶點-疾病”作用網絡模型。該網絡中共有206個節點和512條邊。（見圖4）利用Cytoscape 3.8.0插件CytoNCA行拓撲分析，選擇介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、借助度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、局部邊連通性（LAC）和網絡中心性（NC）對靶標進行篩選，選擇大于所有指標中位數的基因進行后續分析。兩次篩選標準如下。第一次：BC：72.67，CC：0.21，DC：7.00，EC：0.05，LAC：2.50，NC：3.33；第二次：BC：17.00，CC：0.57，DC：10.00，EC：0.14，LAC：4.86，NC：5.91。（見圖5）將篩選到的靶標逐個輸入BioGPS數據庫進行組織特異性表達篩選，篩選標準：（1）靶點為最高表達；（2）組織特異性表達水平>中位數的5倍。（見表3）最終得到11個關鍵靶點，即TP53、HIF1A、TNF、CDKN1A、MAPK14、FOS、AKT1、MAPK1、STAT1、RELA、MYC。（見表4）將上述靶標進行后續分子對接。

圖2 玉屏風散活性成分靶點與上呼吸道感染靶點韋恩圖

圖3 玉屏風散活性成分-主要靶點的PPI 網絡圖

圖4 玉屏風散“活性成分-作用靶點-疾病”網絡圖

圖5 交集靶點的拓撲分析

表3 BioGPS 數據庫組織特異性表達篩選結果

表4 關鍵靶點信息

2.3 功能和通路富集分析 對玉屏風散防治上呼吸道感染的交集靶點進行GO/KEGG富集分析，限定P＜0.05，獲得2 768個GO條目及176條通路。相關信號通路包括AGE-RAGE、IL-17、TNF信號通路等。GO條目發現生物過程（BP）共2 362條，涉及細胞對活性氧的反應、抗生素反應、金屬離子反應、活性氧代謝、氧化應激反應等；分子功能（MF）共197條，涉及蛋白激酶復合物、質膜筏、轉錄因子復合物、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物等；細胞組成（CC）共209條，涉及磷酸酶結合、泛素蛋白連接酶結合、細胞因子受體結合、類固醇激素受體、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。（見圖6）

圖6 玉屏風散活性成分-疾病靶點富集分析

2.4 分子對接 選取玉屏風散“中藥成分-作用靶點-疾病”圖中度值排名前10的活性成分與11個關鍵靶點進行分子對接，并繪制熱圖。（見圖7～8）各活性成分與靶點的結合能均小于-5.0 kcal/mol，表明結合度較好。其中beta-sitosterol與AKT1的最低結合能數值最低，具有良好的擬合性。

圖7 中藥成分-關鍵靶點對接熱圖

圖8 活性成分-關鍵靶點分子對接示意圖

3 討論

玉屏風散出自宋代醫家張松《究原方》，由防風、黃芪、白術3味藥組成。方中黃芪甘溫，歸脾、肺經，外可益氣固表止汗，內可健運脾胃中氣，為君藥；白術甘溫，歸脾、胃經，可健脾益氣，助黃芪益氣實衛而密腠理，使汗不外泄，風寒邪氣不得從肌膚而入；防風辛甘溫，歸膀胱、肝、脾經，有辛潤疏風之功效。《靈樞·本臟》云：“衛氣者，所以溫分肉，充肌膚，肥腠理，司開闔者也。”三藥合用，強衛氣，溫分肉，充肌膚，肥腠理，助開闔，恰似御風之屏障，有貴重如玉之本意，名為“玉屏風散”。玉屏風散的中藥歸經主要為脾經、肺經、膀胱經、胃經、肝經，其益氣固表的效用可能是通過作用至上述經絡，從而起效。其方僅3味中藥，簡而效宏，多被用于治療反復上呼吸道感染、過敏性鼻炎、蕁麻疹屬肺脾氣虛而外感風邪者，以及腎小球腎炎易于傷風感冒而致病情反復者[8-10]。上呼吸道感染實際上為機體免疫失衡，感染病毒或細菌的表現。對于反復發作的患者而言，適逢受涼、天氣變化、過度疲勞均可誘發此病。對于大多數人群而言，本病并未影響健康狀況，但對于老幼體弱、患有慢性呼吸道疾病的人群而言，本病極易引發其他疾病，甚至出現嚴重的并發癥。增強免疫力，提高抗細菌、抗病毒能力是防治上呼吸道感染的關鍵，尤其是對于老年人與嬰幼兒而言[11-12]。

本研究共得出中藥成分38種，其中包括3β-乙酞氧基蒼術酮、8β-乙氧基蒼術內酯Ⅲ、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-順式折術三醇、漢黃芩素、β-谷甾醇、5-O-甲基維斯阿米醇、槲皮素、山奈酚、芒柄花素等成分，表明上述成分可能是玉屏風散發揮效用的物質基礎。在此基礎上，本研究進一步通過文獻檢索，探討了玉屏風散各成分的藥理作用。臨床研究表明，玉屏風散治療上呼吸道感染具有良好的療效，對其他呼吸道疾病也具有一定的防治作用[6,13-15]。黃芪在調節免疫、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病、延緩衰老等方面具有重要作用，其具體成分以多糖、三萜、黃酮等成分為主[16-18]。周怡錦等[19]通過構建肺脾氣虛反復呼吸道感染（recurrent respiratory tract infection，RRTI）大鼠模型，探究不同劑量黃芪甲苷對輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（Treg）平衡的影響，發現黃芪甲苷可能通過抑制白細胞介素-6（IL-6）/酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）信號通路，促進肺脾氣虛RRTI模型大鼠Th17/Treg細胞的平衡，從而達到防治反復呼吸道感染的作用。黃芪甲苷Ⅳ可促進H1N1觸發的自噬體和溶酶體的形成，顯著降低白細胞介素-1β（IL-1β）的表達，減輕炎癥因子風暴，從而可有效干預宿主H1N1感染[20]。白術具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的作用，為常見的菊科藥用植物[21]。其化學成分涵蓋半萜和三萜類、聚乙炔類、多糖類、香豆素和苯丙素類、黃酮和黃酮苷類、苯醌類、三萜類、甾體類及其他類，其生物學效應主要集中在抗衰老、延緩神經退行性疾病、抑制神經細胞凋亡、抗腦缺血、調節腸道微生態、抗血小板聚集、抗腫瘤、抗炎、保肝及改善胃腸道功能障礙等方面[22-25]。白術有健脾益氣之功效。在玉屏風散的配伍組成中，白術通過補益脾胃、健運中洲，發揮“培土生金”、補益肺氣的功效[26]。有學者使用白術多糖干預硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導的潰瘍性結腸炎小鼠，并采用腸道微生物群分析和非靶向糞便和血漿代謝組學分析，結果表明白術多糖可調整潰瘍性結腸炎小鼠腸道微生物群，促進短鏈脂肪酸的產生，還可以調節消化食物，從而起到調整腸道菌群代謝的作用[27]。曹艷霞等[28]研究發現白術多糖可降低運動應激性潰瘍模型大鼠的胃潰瘍指數，提高胃黏膜組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低胃黏膜組織丙二醛（MDA）含量，促進B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）表達，抑制促凋亡蛋白（Bax）表達。白術多糖可有效提高胃黏膜的抗氧化能力，抵抗胃黏膜損傷所致的細胞凋亡[28]。防風為傘形科植物防風未抽花莖植株的干燥根，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，現在多用于防治外感風寒、周身疼痛、頭痛目眩、風寒濕痹、骨節疼痛[29]。防風中化學成分主要為多糖、色原酮、揮發油、香豆素等活性成分，具有解熱、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、提高免疫力、抗凝血、抗過敏等藥理活性[30-31]。有研究表明，防風提取物具有抗增殖和抗氧化活性，對慢性髓性白血病急變期細胞（K562）、白血病細胞（HL60）、乳腺癌細胞（MCF7）等人類腫瘤細胞株具有抗增殖作用，對人乳腺癌細胞（MDA-MB-468）具有拮抗作用，對脂多糖活化的單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）具有抗氧化、抗炎的特性[32]。

在得出170個交集基因后，本研究使用拓撲分析的方法，結合BioGPS數據庫進行組織特異性篩選，共得到11個關鍵靶點，即腫瘤蛋白p53（TP53）、低氧誘導因子-1（HIF1A）、腫瘤壞死因子（TNF）、周期素依賴性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、原癌基因（FOS）、蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、絲裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）、信號傳導轉錄激活因子1（STAT1）、轉錄因子p65（RELA）、原癌基因（MYC）。GO/KEGG富集分析結果顯示，玉屏風散防治上呼吸道感染主要涉及細菌來源分子反應、氧化應激反應、脂多糖反應、抗生素反應、缺氧、細胞凋亡等生物學過程及晚期糖基化終產物及其受體（AGE-RAGE）、白細胞介素-17（IL-17）、TNF等信號通路。這表明玉屏風散可能通過作用于AGE-RAGE、IL-17、TNF信號通路，調控TP53、HIF1A、TNF等靶點，從而發揮防治上呼吸道感染的作用。TP53是17號染色體的基因，TP53負責誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復或代謝改變，這與人類多種生物學過程密切相關[33]。有學者探討了TP53對SARS-CoV-2受體ACE2基因的調控作用，結果表明TP53的缺陷會導致組織和性別特異性的表達變化[34]。HIF-1普遍存在于人和哺乳動物細胞內，常氧下也有表達，但合成的HIF-1蛋白很快即被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下HIF-1才可穩定表達。其涉及缺氧、免疫、炎癥反應、胚胎發育等多種生物學進程[35-36]。SARS-CoV-2 ORF3a可誘導線粒體損傷和線粒體ROS的產生，從而促進HIF-1α的表達。這表明HIF-1α在促進SARS-COV-2感染和誘導COVID-19的炎癥反應中起重要作用。此外，該研究亦發現，HIF-1α還可廣泛促進其他病毒的感染。HIF-1α可能是中藥治療呼吸道感染性疾病的重要靶標[37-38]。AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路均介導炎癥反應、細胞凋亡的發生發展，亦參與呼吸道疾病的發生發展[39-41]。

分子對接結果顯示，槲皮素、山奈酚、漢黃芩素與FOS、AKT1等靶點具有良好的切合度。FOS可與Jun家族的蛋白質聚合，形成轉錄因子復合物AP-1，而AP-1調控了細胞的諸多進程，如分化、增殖、凋亡等。在應對壓力、細菌和病毒的感染時，其通過調節自身及靶基因的表達量，從而發揮特定的效應[42]。AKT1則是細胞凋亡與糖代謝的關鍵基因，目前對其的研究主要集中在肺癌、急性胰腺炎等疾病中，AKT1的異常激活可能是機體糖代謝障礙及細胞過度凋亡的關鍵因素[43-44]。分子對接結果顯示，TP53、HIF1A、TNF、CDKN1A、MAPK14、FOS、AKT1、MAPK1、STAT1、RELA、MYC等靶點與玉屏風散中各中藥成分的結合度較好，可能是其防治上呼吸道感染的潛在靶標。

綜上所述，玉屏風散可能通過調節自身免疫，介導氧化應激反應、抗生素反應、細胞凋亡等一系列生物學反應，激活AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路，調控TP53、HIF1A、TNF等靶點，從而發揮防治上呼吸道感染的作用。然而，由于本研究尚缺乏有效的實驗作為驗證，且目前受數據庫收錄靶點信息及疾病相關信息的限制，需開展體內外實驗驗證預測靶點，以期進一步指導臨床治療。