廣州市花都地區罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型分布及血液學特征*

鞠愛萍,付曉彤,劉艷霞,林 鏗,許碧秋,陳武玲,孟祥榮

1.廣東省廣州市花都區婦幼保健院檢驗科,廣東廣州 510800;2.南昌大學瑪麗女王學院,江西南昌 330031

珠蛋白生成障礙性貧血又稱為地中海貧血,簡稱地貧,是一種常染色體單基因隱性遺傳病,是一組世界上最常見的慢性溶血性貧血病,主要以α、β-地貧最為常見[1]。當前國內市場上的地貧診斷試劑盒提供的檢測范圍主要是針對我國南方常見的6種α-地貧和17種β-地貧的基因類型,檢測范圍涵蓋了我國人群中95%～98%的α、β-地貧基因型,在一定程度上會造成2%～5%的罕見或未知突變地貧基因型漏診。隨著分子檢測技術的不斷發展,罕見或未知突變地貧基因型不斷被發現。廣州市花都地區是地貧高發區,對常規α、β-地貧的基因型及血液學表型已有相關文獻報道[2-3],但對罕見地貧的研究尚處于初期階段,基于此,本研究以血液學特征為基礎,開展了罕見地貧基因型檢測,調查了廣州市花都地區人群罕見地貧基因型的分布及其血液學表型特征,探討了該地區罕見地貧人群攜帶率,闡述了罕見地貧基因型與表型的關系,不僅可完善該地區地貧基因突變譜,還可為地貧產前咨詢和防控提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至 2022年6月在廣州市花都區婦幼保健院進行地貧基因檢測者33 014例患者作為研究對象。罕見α-地貧納入標準:平均紅細胞體積(MCV)<82 fL和(或)平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)<27 pg、血紅蛋白(Hb)A2<2.5%,但常見地貧基因型為陰性或基因型與血液學表型不一致者或已生過重型α-地貧患兒但未找到原因者。罕見β-地貧納入標準:MCV<82 fL和(或)MCH<27 pg、且HbA2≥3.5%或(和)HbF≥5.0%,常規地貧基因型為陰性或中重型β-地貧表型,但常規基因型為雜合子者。排除標準:缺鐵性貧血、鉛中毒、甲狀腺功能亢進癥、嚴重感染者及其他類型的Hb病者。所有患者均了解本研究并簽署知情同意書。本研究經花都區婦幼保健院倫理委員會審批通過。

1.2試劑與儀器 選用Sysmex XN-1000全自動血液分析儀(日本Sysmex公司)、ABI2720擴增儀(美國ABI公司)、Capillary2全自動毛細管電泳儀(法國SEBIA公司)、HB-2012A醫用核酸分子快速雜交儀(廣東潮州凱普公司)、YY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)、ABI 3500 DNA測序儀(美國ABI公司)等設備。常規α、β-地貧基因檢測試劑盒均購自廣東潮州凱普公司。

1.3方法

1.3.1血液學參數水平測定 采集受檢者外周血2 mL,乙二胺四乙酸二鉀抗凝,顛倒混勻,充分抗凝,每批次實驗均處于在控的狀態時采用Sysmex XN-1000全自動血液分析儀進行MCV(參考范圍:82～100 fL)、MCH(參考范圍:27～34 pg)、Hb(參考范圍:男120～180 g/L,女110～170 g/L)等血液學參數水平測定;使用Capillary2全自動毛細管電泳儀進行受檢者HbA(參考范圍:94.5%～97.5%)、HbA2(參考范圍:2.5%～3.5%)、HbF(參考范圍:0%～2.5%)及其他異常Hb等檢測。

1.3.2常見地貧基因型檢測 采用跨越斷裂點聚合酶鏈反應(Gap-PCR)聯合導流雜交法檢測6種常見α-地貧的基因型,即--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα和αWSα,以及17種常見β-地貧基因型,即IVS-Ⅱ-654(C-T)、βE(G-A)、CD41-42(-TCTT)、-28(A-G)、-29(A-G)、CD14-15(+G)、CD71-72(+A)、CD27-28(+C)、-30(T→C)、CD17(A-T)、IVS-Ⅰ-1(G-T、G-A)、IVS-Ⅰ-5(G-C)、Int(T-G)、CD43(G-T)、CD31(-C)、-32(C→A)和CAP(A-C或-AAAC)。

1.3.3罕見地貧基因型檢測 (1)罕見α-地貧基因型檢測。Gap-PCR聯合導流雜交法檢測6種常見α-地貧基因型為陰性時,采用Gap-PCR檢測罕見缺失性α-地貧基因型[泰國型地貧(--THAI)和菲律賓型--FIL]也為陰性時,再采用多重連接探針擴增技術(MLPA)檢測未知α-缺失型地貧,Sanger測序分析α-珠蛋白基因罕見點突變;凱普地貧檢測膜條出現4.2淺點時進行α-地貧融合基因檢測;正常對照點、SEA、3.7或4.2三點同時出現時則進行α-地貧香港型地貧基因(HKαα)檢測。(2)罕見β-地貧基因型檢測。反向點雜交技術檢測常見 β-地貧點突變為陰性時,采用Gap-PCR檢測兩種缺失型β-地貧基因型[中國型Gγ+(Aγδβ)0和東南亞型遺傳性持續性胎兒Hb增高癥(SEA-HPFH)]也為陰性時,再采用Sanger測序分析β-珠蛋白基因新發點突變或采用MLPA檢測未知β-缺失型地貧。在HbVar數據庫中查找罕見和未知的突變位點。

2 結 果

2.1罕見地貧基因型檢出情況 33 014例受檢者中檢測出疑似罕見地貧基因型突變樣本188例,年齡1個月至55歲。最終診斷為罕見地貧基因型94例,其中罕見α-地貧基因型46例,罕見β-地貧基因型48例。罕見地貧基因型檢出率為0.28%(94/33 014),罕見α-地貧基因型檢出率為0.14%(46/33 014),罕見β-地貧基因型檢出率為0.15%(48/33 014)。

2.2罕見α-地貧基因型分布及血液學特征 罕見α-地貧基因型共有11種突變類型,α基因缺失型和融合型37例4種類型:1例HKαα/αα、7例--SEA/HKαα、3例-α4.2/HKαα及1例合并β17/βN、4例--THAI/αα;20例 Fusion gene/αα;1例αααanti4.2。α-地貧突變型9例7種類型:2例CD 40、2例3′UTR +71 G>C、2例IVS Ⅱ-55 T>G、1例IVS Ⅱ-119-126-CTCGGCCC>+G)、1例IVS Ⅱ-119 G>CTCGGCCC、1例CD 124 TCC>ACC、1例IVS Ⅱ-107G>C。基因型HKαα/αα、αααanti4.2、3′UTR +71 G>C及其復合-α3.7/αα、IVS Ⅱ-119 G>CTCGGCCC復合IVS Ⅱ-55 T>G復合-α4.2/αα的MCV、MCH正常,HbA2正常或稍低,而Fusion gene/αα的MCV、MCH處于臨界值、HbA2正常。其余類型的MCV、MCH均降低,HbA2正常或降低,在復合β-地貧時HbA2則升高。見表1、2。

表1 罕見缺失型和融合型α-地貧基因型分布及其血液學特征

表2 罕見突變型α-地貧基因型分布及其血液學特征

2.3罕見β-地貧基因型分布及血液學特征 罕見β-地貧基因型共8種突變類型,β-基因缺失型37例2種類型,分別為10例中國型Gγ+(Aγδβ)0,27例SEA-HPFH;β-基因突變型11例6種類型,6例-90、CD37、IVS Ⅱ-2-T、IVS Ⅱ-132、IVS Ⅱ-300-308、IVS Ⅱ-667 各1例。中國型Gγ+(Aγδβ)0和SEA-HPFH雜合子及復合--SEA/αα的MCV、MCH均降低,HbF均升高,中國型Gγ+(Aγδβ)0的HbA2正常,而SEA-HPFH的HbA2升高。β-點突變單純雜合子的MCV、MCH均降低,除IVS Ⅱ-300-308、IVS Ⅱ-667 T>C的HbA2正常或稍低外,其他類型均升高。見表3、4。

表3 罕見缺失型β-地貧基因型分布及其血液學特征

表4 罕見突變型β-地貧基因型分布及其血液學特征

3 討 論

本研究共發現罕見α-地貧基因型46例,罕見β-地貧基因型48例,表明罕見α、β變異攜帶者在該地區人群中占有一定的比例,罕見地貧基因型檢出率為0.28%(94/33 014),罕見α-地貧基因型檢出率為0.14%(46/33 014),罕見β-地貧基因型檢出率為0.15%(48/33 014),罕見基因型的攜帶主要以雜合子為主,其中α基因變異占48.94%(46/94),β基因變異占51.06%(48/94)。α、β點突變在外顯子和內含子區域均可發生,α點突變多數發生在功能較強的α2基因上;β點突變可發生在編碼區,也可以發生在5′和3′端的非編碼區,部分點突變可引起相應的血液學表型變化。

HKαα是一種較為罕見的α-地貧基因型,采用凱普試劑盒Gap-PCR檢測時結果顯示為-α3.7/αα,而真實結果可能為-α3.7/αα、-α3.7/HKαα或HKαα/αα。有研究表明,福建省人群中HKαα檢出率為0.36%,HKαα在-α3.7陽性標本中的檢出率為7.27%[4]。本研究在檢測膜條正常對照點、SEA、3.7或4.2三點同時出現時才進行α-地貧HKαα檢測,并沒有針對檢測結果為-α3.7/αα的樣本進行HKαα檢測。據報道,廣東地區HKαα/αα在-α3.7陽性標本中的檢出率為4.31%[5],說明本研究報道應該存在一定比例的漏診。本研究共檢測出12例HKαα,檢出率為0.04%(12/33 014),其真實的檢出率應該高于0.04%,其中檢測出7例--SEA/HKαα,檢出率為0.02%(7/33 014),低于相關研究地貧--SEA/HKαα的檢測率(0.03%)[6];--SEA/HKαα屬于輕型地貧,臨床癥狀與--SEA/αα相似,但明顯輕于--SEA/-α3.7,故當夫婦雙方一方為HKαα/αα、另一方為--SEA/αα時不屬于地貧高風險家庭,可以不用做產前診斷[7]。本研究還檢出3例-α4.2/HKαα,其MCV、MCH處于正常范圍,無貧血癥狀,屬于靜止型地貧,而-α4.2/HKαα復合β17/βN的MCV、MCH明顯降低,HbA2升高,表現為β-地貧的血液學表型,原因應該是由于HKαα合并β-地貧時加劇了α、β的不平衡所致。

--THAI為α-蛋白基因簇的大片段缺失,在我國南方是僅次于常規3種缺失型的地貧。有研究報道,在廣西壯族自治區梧州市1 365對地貧篩查雙陽受檢者中檢出8例--THAI,檢出率為0.59%[8]。有研究在1 543對夫婦中檢出7例,檢出率為0.45%[9],當合并其他類型α地貧基因型時也會產生中、重型地貧。現已有--THAI合并--SEA產生重型地貧胎兒的文獻報道,而且發生水腫癥狀更早[10]。本研究檢測出4例,檢出率為0.01%(4/33 104),其中1例女方地貧基因型為--THAI/αα復合SEA-HPHF/βN,男方地貧基因型為-α3.7/αα復合βN/βN,這對夫婦應納入地貧高風險人群,懷孕后應及時做產前診斷,以防生育--THAI/-α3.7中間型地貧患兒。

α-融合基因最先是在2013年1例家系分析中被檢出,據文獻報道,α-地貧融合基因合并--SEA/時可引起HbH病[10]。夫婦一方為α-地貧融合基因、另外一方為--SEA/αα地貧時可能會有生育HbH病患兒的風險,應該做產前診斷[11]。在2019年海南黎族人群中1例家系的文獻報道中融合基因雜合子呈小細胞低色素性貧血,MCV、MCH明顯降低,輕度貧血[12]。2020年有學者報道了采用多色探針熔解曲線方法檢測融合基因,并用一代測序技術進行了驗證[13]。2021年本研究團隊報道了廣州市花都地區融合基因檢測方法及應用評價,詳細介紹了采用Gap-PCR對融合基因的篩查及應用評價[14]。本研究共檢測出20例Fusion gene/αα,檢出率為0.06%(20/33 104),MCV和MCH均在臨界范圍,攜帶者臨床表型正常,與相關報道有所不同[12],說明融合基因具有明顯的人群和地域差異,與廣州市花都地區以本地客家人群為主有關,是否為客家人常規攜帶的地貧基因型尚有待于進一步考究。

本研究缺失型罕見β-地貧包括中國型Gγ+(Aγδβ)0和SEA-HPFH兩種基因類型,二者均以HbF高為特點,雜合子一般無貧血表現,由于發病機制不同,SEA-HPFH臨床表型要輕于中國型Gγ+(Aγδβ)0,當合并常見β-地貧時可產生中、重型臨床表型。所以,當夫婦雙方一方為缺失型β-地貧、另一方為常見β-地貧時要做產前診斷[15]。本研究檢測出中國型Gγ+(Aγδβ)0雜合子9例,SEA-HPFH雜合子24例,1例SEA-HPFH/β-28,HbF高達77.40%,HbA2為3.80%;有文獻報道,中國型Gγ+(Aγδβ)0復合βE,HbF高達54.1%,HbA2為2.5%[16]。以上說明HbF可以代替HbA行使功能,在合并不同常見β-地貧基因型時血液學表型不同。-90位點最早是在葡萄牙人群中被發現[17],本研究檢出6例HBB:c.-140C>T (-90 C>T)位點的地貧,3例為雜合子突變,1例為合并α1基因HBA1:c.301-24CTCGGCCCdelinsG(IVS Ⅱ-119-126-CTCGGCCC>+G)位點突變的雜合子,1例合并-α3.7/αα,1例合并-α4.2/αα,單純的雜合子突變為小細胞低色素性血液學表型,有少量的HbF存在,HbA2≥3.5%,是輕型β-地貧的表現,與相關報道結論一致[18]。

綜上所述,廣州市花都地區罕見地貧基因型復雜多樣,具有獨特的血液學特性,突變在外顯子和內含子、編碼區和非編碼區均有分布。對廣州市花都地區出現的相對高頻的特有地貧基因型,如-90、融合基因應該有針對性地納入廣州市花都地區免費地貧篩查范圍;在臨床工作中一定要堅持基因型和血液學表型相一致的原則,并結合受檢者臨床癥狀、不良孕產史及B超影像學檢查等綜合分析,使用其他先進技術進一步檢測以確診,防止漏檢,以此發現更多的罕見地貧基因型及新發突變,對產前地貧咨詢和地貧防控措施的完善具有指導作用。