右美托咪定通過(guò)抑制NF-κB及炎癥因子減輕失血性休克大鼠急性肺損傷*

白毅平,江偉哲,李富裕,魏繼承,莫利群△

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,四川瀘州 646000;2.四川省人民醫(yī)院麻醉科,四川成都 610000

急性肺損傷(ALI)是由于各種原因引起肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生特征性病理改變而出現(xiàn)的臨床綜合征[1-2]。目前認(rèn)為,ALI本質(zhì)是肺內(nèi)過(guò)度性、失控性炎癥反應(yīng)[3]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是最重要的前炎癥因子[4],可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng);白細(xì)胞介素(IL)-6是體內(nèi)主要的促炎性細(xì)胞因子之一,IL-10是體內(nèi)主要的抗炎性細(xì)胞因子之一,有利于重建炎性/抗炎性細(xì)胞因子的平衡[5]。核因子κB(NF-κB)是一種蛋白轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用[6]。右美托咪定可減少炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)[7-8],對(duì)ALI具有一定的保護(hù)作用[9]。同時(shí)有研究表明,右美托咪定的器官保護(hù)作用可能與激活膽堿能抗炎通路[10]、下調(diào)NF-κB表達(dá)的抗炎途徑[11]、抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)炎癥通路[12]、直接抑制單核巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)有關(guān)[13]。既往有研究表明,右美托咪定預(yù)處理能提高ALI大鼠48 h內(nèi)生存率,提示其具有肺保護(hù)作用,但并未指出右美托咪定明確肺保護(hù)作用的有效劑量,且是否通過(guò)抑制NF-κB表達(dá)而減少炎癥因子而減輕肺損傷。本研究探討了右美托咪定是否通過(guò)抑制NF-κB、減少炎癥因子而減輕失血性休克大鼠ALI,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 健康SD雄性大鼠72只(體質(zhì)量250～300 g)購(gòu)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(Con組,假手術(shù))、ALI模型組(ALI組)、小劑量右美托咪定組(Dex-0.5組,0.5 μg/kg)、中劑量右美托咪定組(Dex-1.5組,1.5 μg/kg)、大劑量右美托咪定組(Dex-4.5組,4.5 μg/kg)和NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫化氨基甲酸鹽組(PDTC組)。每組12只。

1.2方法

1.2.1模型制備 SD大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食,自由飲水;腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉,四肢固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上,左側(cè)腹股溝備皮消毒,分離股動(dòng)、靜脈后分別穿刺置管。Con組僅行股動(dòng)、靜脈穿刺。ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組穿刺后待血壓穩(wěn)定10 min經(jīng)股靜脈注入肝素500 U后經(jīng)股動(dòng)脈放血,使平均動(dòng)脈壓(MAP)降至35～45 mm Hg,并通過(guò)放血或回輸血液維持MAP在該水平1 h,建立失血性休克所致ALI大鼠模型。Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組于放血前30 min分別經(jīng)股靜脈給予右美托咪定 0.5、1.5、4.5 μg/kg,10 min泵注完畢。PDTC組于放血前30 min腹腔內(nèi)注射PDTC 200 mg/kg。模型制備完成后將大鼠放回籠中自由進(jìn)食、飲水。

1.2.2血?dú)夥治黾把装Y因子水平檢測(cè) 建模完成后6 h采集股動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?計(jì)算氧合指數(shù)[動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)/吸入氧氣分?jǐn)?shù)(FiO2)]。斷頸處死大鼠。取左肺,行支氣管插管,生理鹽水1 mL進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,反復(fù)灌洗3次后回收支氣管肺泡灌洗液至無(wú)菌離心管中,以1 500 r/min離心10 min,收集上清液,置于-70 ℃冰箱保存,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)灌洗液中IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.2.3肺組織損傷評(píng)分及NF-κB表達(dá)水平檢測(cè) 取右肺上葉測(cè)量肺組織濕/干重比(W/D),右肺下葉生理鹽水沖洗后放入10%甲醛固定、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅染色。鏡檢隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野進(jìn)行肺組織損傷評(píng)分,取平均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1分為正常肺組織結(jié)構(gòu);2分為輕度肺間質(zhì)充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);3分為血管周?chē)[形成,肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞,中度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);4分為肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。采用免疫組織化學(xué)法觀察肺組織NF-κB表達(dá)水平,每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)視野觀察采圖,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為NF-κB免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng),使用專(zhuān)業(yè)圖形分析軟件Image Pro Plus 6.0分析圖像,計(jì)算每張切片的平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠PaO2/FiO2、肺組織損傷評(píng)分及W/D比較 與Con組比較,ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠PaO2/FiO2均降低,ALI組、Dex-0.5組大鼠肺損傷評(píng)分及W/D均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ALI組比較,Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠PaO2/FiO2均升高,Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠肺組織損傷評(píng)分及W/D均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與PDTC組比較,Dex-0.5組大鼠肺組織損傷評(píng)分及W/D均升高,PaO2/FiO2降低差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠PaO2/FiO2、肺組織損傷評(píng)分及W/D比較

2.2各組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平比較 Con組、ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平分別為0.078±0.007、0.466±0.008、0.462±0.005、0.246±0.008、0.166±0.003、0.158±0.003。與Con組比較,ALI組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ALI組比較,Dex-1.5組、Dex-4.5組、PDTC組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與PDTC組比較,ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組、Dex-4.5組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子水平比較 與Con組比較,ALI組、Dex-0.5組、Dex-1.5組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ALI組比較,Dex-1.5組、Dex-4.5組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與PDTC組比較,Dex-0.5組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平均升高,Dex-1.5組大鼠IL-10、TNF-α水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子水平比較

3 討 論

本研究通過(guò)建立大鼠失血性休克ALI模型,并采用不同劑量右美托咪定對(duì)模型大鼠進(jìn)行預(yù)處理,并加入NF-κB特異性抑制劑(PDTC),觀察了右美托咪定是否通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB及炎癥因子水平減輕失血性休克大鼠ALI。大鼠失血性休克模型采用建模更穩(wěn)定的定壓型模型[14]。本研究結(jié)果顯示,ALI組比Con組大鼠PaO2/FiO2降低,肺組織損傷評(píng)分及W/D升高,表明ALI模型建立成功。

既往雖有研究表明右美托咪定預(yù)處理能提高ALI大鼠48 h內(nèi)生存率,提示其具有肺保護(hù)作用[15],但并未指出右美托咪定明確肺保護(hù)作用的有效劑量。本研究結(jié)果顯示,ALI建模前30 min靜脈給予低劑量(0.5 μg/kg)右美托咪定,雖然PaO2/FiO2比ALI組有所改善,但肺組織損傷評(píng)分及W/D無(wú)改善,肺組織水腫仍然明顯、肺損傷嚴(yán)重。然而使用中等劑量(1.5 μg/kg)和大劑量(4.5 μg/kg)右美托咪定預(yù)處理后不僅PaO2/FiO2比ALI組有所改善,而且肺組織損傷評(píng)分及W/D均降低,肺組織水腫及肺組織損傷明顯減輕,提示1.5、4.5 μg/kg右美托咪定能有效減輕肺組織損傷,具有肺保護(hù)作用,與ZHANG等[9]研究結(jié)果一致。本研究使用低劑量(0.5 μg/kg)右美托咪定預(yù)處理ALI模型后肺組織損傷評(píng)分及W/D均無(wú)明顯改善,但PaO2/FiO2有所改善,說(shuō)明0.5 μg/kg右美托咪定對(duì)ALI模型肺功能的改善還是有益的,而1.5、4.5 μg/kg右美托咪定減輕ALI效果更明顯。

NF-κB表達(dá)與炎癥因子及肺損傷存在明顯相關(guān)性。本研究ALI組大鼠建模后肺組織NF-κB表達(dá)水平明顯升高,肺泡灌洗液中促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平也明顯升高。ALI大鼠建模前使用NF-κB特異性抑制劑PDTC后肺組織NF-κB表達(dá)水平明顯降低,肺泡灌洗液中促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α水平也明顯降低;并且肺組織損傷評(píng)分及W/D均降低,PaO2/FiO2升高。既往研究表明,NF-κB活化在引發(fā)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)及肺損傷病理過(guò)程中起重要作用,并且抑制NF-κB 的激活可減輕肺損傷[16-17]。

本研究進(jìn)一步探討了1.5、4.5 μg/kg右美托咪定預(yù)處理對(duì)NF-κB表達(dá)、炎癥因子及減輕肺損傷的作用,結(jié)果顯示,1.5、4.5 μg/kg右美托咪定預(yù)處理能有效抑制肺組織NF-κB的激活,IL-6、IL-10、TNF-α水平均降低,肺組織損傷評(píng)分及W/D也均降低,并存在劑量相關(guān)性,0.5 μg/kg右美托咪定預(yù)處理效果不明顯。有研究發(fā)現(xiàn),大劑量右美托咪定才可通過(guò)激動(dòng)α2-腎上腺能受體并調(diào)節(jié)細(xì)胞Toll樣受體4/NF-κB/MAPKs通路,減少巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10[12]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了4.5 μg/kg右美托咪定通過(guò)抑制NF-κB及炎癥因子水平在大鼠失血性休克ALI模型中的肺保護(hù)作用機(jī)制。在脂多糖ALI動(dòng)物模型中也觀察到1.5、4.5 μg/kg右美托咪定能明顯降低大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎癥細(xì)胞因子水平[9-10]。另外右美托咪定腹腔內(nèi)注射及持續(xù)泵注也顯示了明顯的NF-κB活性抑制作用[18-19],其機(jī)制可能與右美托咪定抑制鈣離子的內(nèi)流相關(guān)[20-21]或通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)鏈的正反饋?zhàn)饔?間接抑制NF-κB激活[20-21]。

綜上所述,1.5、4.5 μg/kg右美托咪定預(yù)處理可減輕失血性休克大鼠ALI,其可能與抑制NF-κB活化及炎癥因子水平的表達(dá)相關(guān)。