心肌梗死介入治療后sTRAIL-R2表達與頸動脈斑塊細胞凋亡及炎癥反應的相關性

陳 芬,李艷萍

陜西省商洛市中心醫院心血管內科,陜西商洛 726000

心血管疾病是世界范圍內導致死亡的主要原因,通常由動脈粥樣硬化所致,是發生心肌梗死等心臟事件的基礎[1-2]。頸動脈易損斑塊的破裂和血栓形成是引起心肌梗死、腦梗死等重大心腦血管疾病的主要原因之一[3]。影響斑塊易損性的因素主要包括免疫炎癥反應、細胞外基質降解、脂質代謝異常、氧化應激、細胞凋亡及血管新生等。細胞凋亡可以通過內在的線粒體途徑和外在的死亡受體相關途徑兩種不同的途徑啟動。死亡受體配體——腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)可通過可溶形式的可溶性TRAIL(sTRAIL)釋放,與sTRAIL受體2(sTRAIL-R2)融合,誘導細胞凋亡,并且已有研究表明,sTRAIL-R2是主要的細胞凋亡誘導受體之一[4-5]。有研究表明,TRAIL-R2的激活在體外可誘導巨噬細胞、人主動脈血管平滑肌細胞和內皮細胞凋亡,從而可能有助于易損斑塊表型形成,且sTRAIL-R2水平可預測普通人群的心血管事件發生風險[6]。但關于此類研究,國內相關文獻報道較少見。因此,本研究采用頸動脈內膜切除術標本探究斑塊微血管中sTRAIL-R2的表達水平,并分析其與患者機體炎癥反應和斑塊細胞相關性,旨在為此類患者預后評估提供參考依據。

1 資料與方法

1.1樣本來源 選擇2021年1月至2022年5月本院收治的介入治療后行頸動脈內膜切除術心肌梗死患者102例作為研究對象,其中男53例、女49例,年齡41～72歲,平均(53.27±5.35)歲。所有患者均了解本研究并簽訂知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審批通過。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要試劑 蘇木精-伊紅染色試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司,DAPI染色試劑盒購自南京凱根生物科技有限公司,免疫組織化學試劑盒購自默克生物公司,酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司,半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 比色測定試劑盒購自上海博爾森生物科技有限公司,山羊抗小鼠β-actin、Bax、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Caspase-3一抗均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2.2主要儀器 包括細胞計數器(上海上碧實驗儀器有限公司)、Couvter型高速冷凍離心機(美國Beckman公司)、DM 750型光學顯微鏡(日本Olympus公司)、Spectra Max M5型多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)、XDS-3型倒置顯微鏡(青島愛普科生物工程有限公司)、流式細胞儀(德國Partec公司)、滑動式切片機(北京盛科信德科技有限公司)等。

1.3方法

1.3.1標本獲取及sTRAIL-R2檢測 行頸動脈內膜切除術后頸動脈斑塊立即在實驗室進行處理。將獲取樣本切分為長5 mm的片段,對斑塊負荷最大的片段進行標準化組織學檢查。使用酶聯免疫吸附試驗檢測每個片段sTRAIL-R2表達水平,分為sTRAIL-R2高表達(>15 pg/mL)組和sTRAIL-R2低表達(≤15 pg/mL)組。

1.3.2免疫組織化學 獲取的斑塊組織用10%福爾馬林固定,二甲苯脫蠟2次,梯度乙醇脫水,蒸餾水和磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。然后將組織與1滴過氧化氫孵育10 min,并用PBS洗滌9 min。加入0.01 mol/L 檸檬酸鹽 (pH 6.0) 后進行微波抗原修復20 min。用PBS洗滌9 min后切片與正常山羊血清孵育5 min。去除血清后 4 ℃ 用兔抗CD45、CD68單克隆抗體孵育過夜,然后用PBS洗滌,接著加入山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗,37 ℃孵育30 min,PBS洗滌3次,每次3 min。然后將組織用新制備的二氨基聯苯胺顯色1～2 min,浸入PBS 3次,每次2 min。隨后將切片用蘇木精復染1 min。顯微鏡下觀察,計算陽性細胞數及陽性細胞所占比例。

1.3.3酶聯免疫吸附試驗 將獲取的斑塊組織用1 mL組織裂解緩沖液裂解,冰浴且在玻璃研磨機中研磨成勻漿,4 ℃裂解 30 min,然后4 ℃、300×g 離心20 min取上清液,使用酶聯免疫吸附試驗檢測白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β、C反應蛋白(CRP)表達水平。

1.3.4Caspase-3、Caspase-8活性檢測 將獲取的斑塊組織用1 mL組織裂解緩沖液裂解,冰浴且在玻璃研磨機中研磨成勻漿,4 ℃裂解30 min。將細胞裂解液300×g離心15 min,上清液保存在冰上進行即時測定。然后將5 mL裂解物加入96孔板中,將Caspase-3、Caspase-8顯色底物5 μL加入每個孔中,并在37 ℃下孵育1 h。通過Caspase比色測定試劑盒進行檢測,在微量滴定板讀數器上405 nm 處記錄吸光度值。通過比較處理過的細胞與對照組的結果確定Caspase-3、Caspase-8活性增加的百分比。

1.3.5蛋白質印跡檢測 從斑塊組織中提取總蛋白質樣品。斑塊組織用預冷的組織裂解液勻漿,4 ℃、12 000 r/min 離心15 min取上清液。使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質水平。將等水平的蛋白質裂解物加載到10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳上,電泳80 V、30 min和 120 V、60 min,然后電轉移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h。將膜與Bax、Caspase-3、Bcl-2、β-actin 抗體4 ℃過夜,然后清洗膜并與適當的辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。最后使用增強型化學發光檢測系統(Clinx Science Instruments,U.S.A.)觀察蛋白質條帶。測量 β-actin表達水平作為內源參考并用于標準化。根據2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。

2 結 果

2.1兩組患者斑塊組織sTRAIL-R2表達水平比較 共獲取297個頸動脈內膜片段。sTRAIL-R2高表達組150個片段,sTRAIL-R2低表達組147個片段。sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織sTRAIL-R2水平[(19.01±3.24)pg/mL]高于sTRAIL-R2低表達組[(10.81±4.12)pg/mL],差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2兩組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性比較 sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性均高于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性比較

2.3兩組患者斑塊組織Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較 sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織Bax、Caspase-3蛋白表達水平均高于sTRAIL-R2低表達組,Bcl-2蛋白表達水平低于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 兩組患者斑塊組織蛋白質免疫印跡檢測結果

表2 兩組患者斑塊組織Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較

2.4兩組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細胞檢出數比較 sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細胞檢出數均高于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細胞檢出數比較個/mm2)

2.5兩組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平比較 sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平均高于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平比較

2.6sTRAIL-R2表達水平與細胞凋亡及炎癥反應指標水平的相關性 sTRAIL-R2表達水平與Caspase-8、Caspase-3活性,CD45、CD68、IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平及Bax、Caspase-3蛋白表達水平均呈正相關(r=0.486、0.401、0.511、0.476、0.510、0.485、0.445、0.518、0.394、0.548、0.559,P<0.05),與Bcl-2蛋白表達水平呈負相關(r=-0.681,P<0.05)。見表5。

表5 sTRAIL-R2表達水平與細胞凋亡及炎癥反應指標水平的相關性

3 討 論

TRAIL-R2和TRAIL影響動脈粥樣硬化斑塊的發展,但關于其可溶性形式及與人類動脈粥樣硬化斑塊生物學的實際關聯知之甚少。已有體外實驗表明,TRAIL-R2的激活可誘導細胞凋亡[7],其中Caspase 激活是細胞凋亡誘導相關的關鍵途徑之一。Caspase-3(一種效應子或執行型 Caspase)識別并分離各種靶蛋白中的短氨基酸序列,導致細胞死亡,其作為代表性的執行者在細胞凋亡中起著舉足輕重的作用[8]。Caspase-8可通過分離Bid蛋白從而進一步與 Bax結合,導致細胞色素C釋放,引起細胞凋亡[9]。此外,Caspase-8還以Caspase前體酶原的形式存在大多數動物的細胞中,其可在凋亡信號的作用下首先激活啟動型Caspase引發級聯反應,通過活化的執行型Caspase裂解特異性底物導致細胞凋亡[10-11]。Bcl-2 家族由抗凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax組成。Bcl-2是具有代表性的凋亡抑制因子,而Bax可以與Bcl-2結合形成異源二聚體,拮抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用,促進細胞凋亡[12];另一方面Bax還激活Caspase-3,促進鈣離子釋放,進而導致細胞凋亡[13]。因此,Bax、Bcl-2和Caspase-3被認為是評價細胞凋亡的指標。本研究結果顯示,sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織Caspase-8、Caspase-3活性均高于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05),證實sTRAIL-R2水平變化可能引起斑塊細胞凋亡(活性Caspase-3)和外在死亡受體相關的細胞凋亡途徑(活性Caspase-8)表達水平變化,而相關性分析進一步證實,其水平與Caspase-8、Caspase-3活性呈正相關(P<0.05),證實sTRAIL-R2表達可通過影響患者斑塊細胞內在及外在凋亡途徑影響其細胞凋亡。此外,本研究sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織Bax、Caspase-3蛋白表達水平均高于sTRAIL-R2低表達組,Bcl-2蛋白表達水平低于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。相關性分析也顯示,sTRAIL-R2表達水平與Bax、Caspase-3蛋白表達水平呈正相關(P<0.05),與Bcl-2蛋白表達水平呈負相關(P<0.05)。證實sTRAIL-R2高表達還會進一步調控患者動脈斑塊細胞凋亡相關蛋白表達,從而介導患者斑塊細胞凋亡增加,影響患者病情進展。

炎癥反應是斑塊發展和易損性的另一個關鍵因素[14]。有研究表明,sTRAIL-R2可通過影響免疫細胞微血管屏障外滲,對炎癥細胞浸潤發揮作用。因此,sTRAIL-R2高表達可能導致免疫細胞浸潤增加[15]。而本研究發現,sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織CD45、CD68陽性細胞檢出數高于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05),且與CD45、CD68水平均呈正相關(P<0.05),進一步證實sTRAIL-R2高表達會引起白細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤,加重患者病灶部位炎癥反應,進而引起病情進展。同時本研究還對患者病灶部位炎性細胞因子表達進行了檢測,結果顯示,sTRAIL-R2高表達組患者斑塊組織IL-6、IL-10、CRP水平均高于sTRAIL-R2低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05),且與IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、IL-1β水平均呈正相關(P<0.05),進一步證實了sTRAIL-R2高表達加重患者病灶炎癥反應的猜想。進一步分析sTRAIL-R2高表達可能引起免疫細胞浸潤增加,導致患者斑塊易損,誘發嚴重心腦血管疾病。由于免疫細胞浸潤和血管內側平滑肌細胞增殖,細胞數量的增加產生了對氧氣和營養物質的需求,再加上遠離外膜層供應滋養管的生長,引起斑塊變得缺氧,刺激微血管從外膜生長到含有粥樣斑塊的內膜,同時吸引免疫細胞,進一步加劇炎癥反應和疾病進展[16]。新形成的血管通常不成熟且具有滲漏性,易出現出血等不良事件,導致病變內的間質壓力增加及被巨噬細胞吸收的游離膽固醇積累,這些過程增加了斑塊的不穩定性并增加了破裂的風險[17]。

本研究不足:(1)本研究作為一個橫斷面研究,無法進一步證實患者sTRAIL-R2表達與其斑塊炎癥反應、細胞凋亡相關因子表達的因果關系,這也是未來研究工作的重點之一;(2)本研究未進行細胞層次實驗或動物實驗進一步觀察sTRAIL-R2表達對心肌梗死患者介入治療后細胞凋亡分子層面作用機制,僅能通過患者最終表達進行分析,深入研究也是下一步工作重點,進一步研究可通過外在手段對斑塊細胞進行培養并干預其sTRAIL-R2表達,觀察其與斑塊細胞變化的因果關系;(3)本研究納入樣本較少,且全為本院患者,可能缺乏普遍性,下一步需擴大納入樣本進行更深層次分析。雖然本研究具有以上不足,但本研究結果依然具有一定參考價值,希望在下一步工作中進一步完善,為國內相關研究及發展提供幫助。

綜上所述,sTRAIL-R2高表達可引起頸動脈斑塊細胞Caspase-8、Caspase-3活性升高,細胞凋亡相關蛋白表達水平上調并引起患者斑塊炎癥反應加劇,可能導致患者易損斑塊出現,對其進行靶向干預可能可穩定患者病情。