結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545表達與EMT標志物、臨床病理特征和預后的關系

劉玉強,劉 叢,李樂其

河南宏力醫院:1.病理科;2.胃腸肝膽外科,河南新鄉 453400

結直腸癌為常見的消化系統腫瘤,其發病率與病死率居惡性腫瘤的第5位,對健康有嚴重危害[1]。結直腸癌的發生、發展為多因素共同作用的過程,腫瘤相關生物學因子變化可影響癌細胞浸潤、分化等以促進腫瘤的發生、發展[2]。基質細胞衍生因子-1(SDF-1)高表達可促進腫瘤細胞增殖,提高癌細胞增殖速度[3]。肝細胞受體(EPH)家族在腫瘤侵襲、轉移中發揮重要作用,該家族包括配體——肝配蛋白(Ephrin )與EPH,目前被證實與結直腸癌有關,Ephrin B2為血管內皮細胞特異性生長因子,在血管形成過程中發揮重要作用,其水平表達與結直腸癌細胞侵襲和遷移有關[4-5]。鋅指蛋白545(ZNF545)為轉錄因子,可調節細胞增殖、分化、轉移等。有研究表明,ZNF545參與了多種腫瘤發生、發展過程[6]。上皮間質轉化(EMT)為癌細胞浸潤、轉移過程中形態變化的第一步[7],是上皮細胞獲得間質細胞表型過程,具有可逆性。有研究證明,EMT在上皮來源的腫瘤中發揮著重要作用,與腫瘤侵襲、轉移有關[8]。本研究檢測了結直腸癌患者癌組織與癌旁正常組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545的表達情況,并分析了其表達與EMT標志物、臨床病理特征和預后的關系,旨在探究其在結直腸癌進展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年3月至2021年5月本院收治的結直腸癌患者63例,其中男39例,女24例;年齡45～72歲,平均(65.49±5.36)歲;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期16例,Ⅲ～Ⅳ期47例;腫瘤分化程度:中高分化22例,低分化41例;淋巴結轉移43例,遠處轉移17例。納入標準:(1)符合《中國早期結直腸癌及癌前病變篩查與診治共識》標準[9],且經病理組織檢查確診為結直腸癌;(2)術前無抗腫瘤治療;(3)接受規范手術治療;(4)臨床病理資料完整;(5)接受術后隨訪。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤者;(2)無法手術或不能切除癌組織者;(3)預計生存期不足3個月者。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測 將術中收集的結直腸癌組織、癌旁正常組織(距離癌組織邊緣≥2 cm),甲醛固定、石蠟包埋后切片;經二甲苯脫蠟、乙醇脫水,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次;枸櫞酸鈉緩沖液抗原進行熱修復,內源性過氧化物酶在37 ℃下封閉20 min;PBS沖洗3次后分別放置1∶100的SDF-1、Ephrin B2、ZNF545及EMT標志物[包括神經性鈣黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和上皮性鈣黏附素(E-cadherin)]一抗(Abcam公司);4 ℃孵育過夜;室溫復溫半小時后用PBS沖洗3次,SDF-1、Ephrin B2、ZNF545、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin二抗(Abcam公司)37 ℃下孵育半小時,二氨基聯苯胺顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復染,用鹽酸分化,用自來水沖洗,PBS沖洗反藍;梯度乙醇脫水處理,干燥后二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察切片。

1.2.2結果評估 由2名經驗豐富的檢驗醫師通過雙盲法閱片評分。SDF-1表達于細胞質,Ephrin B2與N-cadherin表達于細胞膜與細胞質,Vimentin表達于細胞質,E-cadherin表達于細胞膜,ZNF545表達于細胞質與細胞核,均呈黃色或褐色顆粒。染色強度評分為無染色計0分,弱染色計1分,中度染色計2分,強染色計3分;陽性細胞比例評分為<5%計0分,5%～<30%計2分,30%～<60%計3分,≥60%計4分。總分為染色強度與陽性細胞比例評分乘積,≥3分為陽性,<3分為陰性。

1.3術后隨訪 以電話或門診復診方式進行隨訪,自患者出院后開始,隨訪12個月。記錄兩組患者無復發生存期與總生存期。無復發生存期為確診至局部復發、遠處轉移或最后1次隨訪時間。總生存期為確診至死亡或最后1次隨訪時間[10]。

2 結 果

2.1結直腸癌及癌旁正常組織SDF-1、Ephrn B2、ZNF545表達情況比較 結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2陽性率均高于癌旁正常組織,ZNF545陽性率低于癌旁正常組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 結直腸癌組織及癌旁正常組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545表達情況比較[n(%)]

2.2結直腸癌組織EMT標志物與SDF-1、Ephrin B2、ZNF545表達的相關性 結直腸癌組織N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白陽性率分別為50.79%(32/63)、61.90%(39/63)、33.33%(21/63)。SDF-1、Ephrin B2表達與N-cadherin、Vimentin蛋白表達均呈正相關,與E-cadherin蛋白表達呈負相關,ZNF545與N-cadherin、Vimentin蛋白表達均呈負相關,與E-cadherin蛋白表達呈正相關,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 結直腸癌組織EMT標志物與SDF-1、Ephrin B2、ZNF545表達的相關性

2.3不同臨床病理特征患者結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陽性表達情況 不同分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及遠處轉移患者SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.05);不同性別、年齡患者SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陽性率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同臨床病理特征患者結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545的陽性表達情況

2.4結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陰性、陽性表達患者的預后情況 隨訪期間共失訪4例患者。SDF-1、Ephrin B2陽性表達患者無復發生存率和總生存率均較陰性表達患者低,ZNF545陽性表達患者無復發生存率和總生存率均較陰性表達患者高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。生存曲線見圖1。

圖1 結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陰性、陽性表達患者的Kaplan-Meier生存曲線分析

表4 結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陰性、陽性表達患者的預后情況

3 討 論

結直腸癌為患病率與病死率均較高的一種惡性腫瘤,目前對結直腸癌的治療有效率不足70%[11],手術與放化療等聯合治療措施的緩解率較低。結直腸癌早期發病缺少有效篩查指標,癌胚抗原等上皮腫瘤糖蛋白能在一定程度上提高診斷率,但其篩查靈敏度與特異度較低,有明顯的局限性[12]。故研究結直腸癌發生、發展的機制,尋找高特異度與靈敏度的生物標志物有助于結直腸癌早期診斷和治療,以提高患者生存率。

結直腸癌發病機制復雜,包括遺傳、基因突變等多種因素均可增加腫瘤發生風險。隨著對結直腸癌發生機制與分子生物學行為深入研究發現,分子生物學變化異常為影響腫瘤發生的主要因素,相關蛋白異常表達可提高癌細胞擴散風險,使腫瘤細胞分化或促凋亡過程失常[13]。趨化因子經細胞膜上特異性受體發揮生物學功能,其受體為G蛋白偶聯的跨膜受體,目前公認的趨化因子表達于多種細胞內,包括癌細胞[14-15]。有研究表明,趨化因子——SDF-1在肺癌[16]、結直腸癌[17]等多種腫瘤中發揮作用。本研究結果顯示,結直腸癌組織SDF-1陽性表達率高于癌旁正常組織,與張超峰等[18]研究結果相符,提示SDF-1可能參與了結直腸癌細胞轉移過程,原因為腫瘤微環境中炎癥介質——SDF-1能介導結直腸癌發展過程,為腫瘤轉移、侵襲提供適宜微環境。EPH家族為跨膜蛋白,Ephrin與特定EPH結合發揮作用。有研究表明,Ephrin B2與其介導的EPH B4形成雙向信號傳導系統,參與了腫瘤的發生、發展,Ephrin B2在腫瘤組織中高表達,在正常組織中不表達或低表達[19]。Ephrin B2不僅參與了惡性腫瘤發生過程,還與其侵襲、轉移有關,提示該蛋白可能為腫瘤惡變中早期作用因子,在腫瘤發生、發展、侵襲、轉移中具有重要作用[20]。本研究發現,結直腸癌組織Ephrin B2陽性表達率高于癌旁正常組織,原因為Ephrin B2高水平表達可促進腫瘤發生、分化等過程,故正常組織的表達水平較低,提示Ephrin B2可能在結直腸癌發生、發展中發揮作用。ZNF545為新型鋅指轉錄因子。有研究表明,該因子在人體正常組織中廣泛表達[21]。ZNF545主要定位在細胞核與細胞質內,相對于癌旁正常組織,結直腸癌組織ZNF545陽性表達較低[22]。結直腸癌組織ZNF545表達水平低于癌旁組織的原因為ZNF545啟動子甲基化異常而使其呈低表達,導致結直腸癌組織EMT轉化激活,提高癌細胞轉移、侵襲力。本研究結果還顯示,SDF-1、Ephrin B2、ZNF545陽性表達與患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移和遠處轉移有關,說明SDF-1、Ephrin B2、ZNF545水平異常表達在結直腸癌侵襲、轉移中發揮積極作用。

EMT使有極性、穩定的上皮細胞經生化過程得到間質細胞表型,使癌細胞由基底膜入侵其他健康組織,進入血液淋巴系統而提高癌細胞侵襲、轉移能力[23]。Vimentin、N-cadherin蛋白表達上調,而E-cadherin蛋白表達缺失或下調均與EMT有關。有學者認為EMT是癌細胞侵襲、轉移的標志[24]。劉佩萸等[25]指出,趨化作用可誘導癌細胞發生EMT,促進細胞遷移。SDF-1高表達能分解癌細胞間質成分,可為其增殖、擴散提供條件,為癌細胞黏附與浸潤提供黏附分子[26]。Ephrin B2可提高細胞在細胞外基質的游走力,對癌細胞擴散與轉移具有促進作用[27]。ZNF545可抑制癌細胞增殖以誘導其凋亡,對腫瘤發生、發展具有抑制作用[28]。本研究結果顯示,SDF-1、Ephrin B2表達與N-cadherin、Vimentin蛋白表達均呈正相關,與E-cadherin蛋白表達呈負相關,ZNF545則反之,原因可能為SDF-1、Ephrin B2、ZNF545可通過調控N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達促進EMT進程,參與結直腸癌侵襲、轉移過程。本研究隨訪結果顯示,SDF-1、Ephrin B2陽性表達者無復發生存率與總生存率均低于陰性表達者,ZNF545陽性表達者無復發生存率與總生存率均高于陰性表達者,提示SDF-1、Ephrin B2和ZNF545可能與患者不良預后有關。

綜上所述,結直腸癌組織SDF-1、Ephrin B2陽性表達率較高,ZNF545陰性表達率較高,且與EMT標志物——N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達和患者病理特征、預后有關,可為評估患者預后提供參考。