浙江省鰲江流域河岸植被緩沖帶濕地土壤細菌群落結構特征分析

陳海生，陳韜略，蔡林生，李振宇，陳少平，朱友聰，黃霄宇 ，李晨陽

（1.浙江同濟科技職業學院，浙江 杭州 311231；2.浙江農林大學 數學與計算機學院，浙江 杭州 311300；3.浙江省余姚第二職業中學，浙江 余姚 315430；4.河南職業技術學院，河南 鄭州 450046）

0 引言

河岸緩沖帶是介于河流水體與河岸陸域之間的生態過渡區域，兼具水域生態系統和陸地生態系統2種特性［1］，具有豐富的植物多樣性和微生物多樣性以及獨特的生態系統特征和生態服務功能。河岸植被緩沖帶能夠減緩農業面源污染，其作為河岸帶的重要組成部分以及水陸間重要的生態交錯帶，在控制河岸侵蝕、截留地表徑流中的泥沙和養分、保護河溪水質、為水陸動植物提供生境、維護河溪生物多樣性和生態系統完整性等方面具有重要作用。劉宏偉等［2］研究了河岸緩沖帶不同植被配置方式對重金屬的凈化效果，結果表明相比于裸土和單一草本植物緩沖帶，喬木—草本混合配置緩沖帶對重金屬離子鎘、銅和鉛等有較好的凈化效果；湯家喜等［3］比較了草木犀帶、草木犀與楓楊混合帶以及雜草帶3種類型人工河岸緩沖帶阻控地表徑流和懸浮顆粒物的能力，發現草木犀和楓楊混合帶對地表徑流和懸浮顆粒物的阻控能力最強；趙警衛等［4］比較了草地河岸帶和人工林地河岸帶對徑流污染物TP和TN的截留效果，發現草地河岸帶對地表徑流TP的截留效果顯著優于林地河岸帶的，而對氮元素的截留效果差別不明顯。但關于河岸緩沖帶濕地不同植物根際土壤細菌群落結構和多樣性方面的研究報道并不多見。

浙江省有八大水系，即錢塘江、甌江、椒江、甬江、苕溪、運河、飛云江、鰲江，其中鰲江是水質最差的河流。主要是因為20世紀90年代，鰲江上游的水頭、騰蛟兩鎮制革行業興起，導致鰲江的水體水質急劇惡化，面臨其沿岸植被覆蓋率降低、水土流失嚴重和生物多樣性下降等問題。在鰲江流域綜合干流治理工程中，河岸緩沖帶的生態構建是重點內容，而河岸緩沖帶構建的關鍵是選擇合適的緩沖帶濕地植被物種。

在濕地生態系統中，微生物在纖維素降解、氮的固定和某些污染物的分解過程中具有重要作用［5］。細菌是土壤微生物中數量最多、分布最廣的生物，其功能復雜多樣，對環境變化敏感［6］，在維護濕地生物多樣性、保持濕地生態平衡方面發揮著重要作用［7］。高通量測序技術可以分析環境微生物總體水平上的種群結構，全面準確地反映環境微生物群落的多樣性和群落結構，具有快速、高通量、流程自動化等特點，目前被普遍應用于濕地植物根際土壤微生物群落結構特征的研究［8］。本文以浙江省八大水系中的鰲江為研究區域，比較其河岸緩沖帶濕地上自然生長的牛筋草［Eleusine indica (L.)Gaertn］、白茅［Imperata cylindrica (L.) Beauv］和荻草(Miscanthus sacchariflorus)這3種鄉土禾本科植物根際土壤的細菌群落結構和多樣性，以期為浙江省河岸緩沖帶濕地植被生態恢復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

鰲江位于浙江省東南部，是浙江省獨流入海的最小水系。全長90 km，流經平陽縣13個鄉鎮。其流域年降水量為1700 mm，年徑流量約20億m3，低潮時平均水深0.8 m，年徑流深為1300 mm，年平均含沙量約0.13 kg/m3。多年平均氣溫為16.8 ℃，屬于亞熱帶海洋性季風氣候區。

1.2 樣品采集

選取溫州市平陽縣鰲江流域干流水頭段河岸緩沖帶上自然分布的3種典型建群種植物，即牛筋草、白茅、荻草，于2022年4月用抖落法采集各植物根際土壤樣品［9］。每次共采樣15株，3次重復。混合均勻過篩后取10 g土樣裝入無菌聚乙烯密封口袋中，然后放入干冰盒中郵寄到杭州聯川生物技術股份有限公司。

1.3 PCR 擴增及高通量測序

采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒法(D5625，美國Omega公司）提取土樣的總DNA。細菌16S rRNA的V4和V5區域擴增引物是338F(5′-ACTCL TACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應程序為：98℃預試變性30 s；98℃變性10 s、54 ℃退火30 s、72℃延伸45 s，循環3次；然后72 ℃延伸10 min。對PCR擴增產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后由杭州聯川公司采用Illumina Miseg高通量測序平臺進行測序。使用UPARSE軟件以97%為劃定閾值對細菌16S rRNA序列劃分操作分類單元(OTUs)。

1.4 生物信息學分析流程

根據樣品獨特的條形碼，將配對端序列進行分配，并將建庫引入的barcode和引物序列去除，采用FLASH合并匹配端讀取。根據 fqtrim(v0.94)軟件，在特定的過濾條件下對原始序列讀數進行質量過濾，以獲得高質量的 clean data。采用Vsearch(v2.3.4)軟件對嵌合序列進行過濾。利用DADA2軟件進行解調，獲得特征表和特征序列。Alpha多樣性歸一化到相同的隨機序列并進行計算。然后根據SILVA(release 132)分類器，利用每個樣本的相對豐度對特征豐度進行歸一化處理。Alpha多樣性用于分析樣本物種多樣性的復雜性，各樣品中的Alpha多樣性指標都采用QIIME2軟件進行計算，通過對樣本Chao1指數和Shannon指數的計算，反映樣本內物種的復雜性和多樣性［8-9］。采用Blast軟件進行序列比對，每個代表性序列用SILVA數據庫對特征序列進行注釋。使用R(v3.5.2)軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 不同植物根際土壤細菌Alpha多樣性分析

由表1可知，3種河流緩沖帶濕地建群種植物根際土壤細菌有效序列數以荻草根際土壤樣品的最多，其次是牛筋草根際土壤樣品的，而白茅根際土壤樣品的細菌有效序列數最少。各土壤樣品的有效序列占比均大于78%，3種植物根際土壤細菌的OTUs數介于7374~8384個，以白茅根際土壤樣品的OTUs數最多，為8384個，其次是荻草根際土壤樣品的，為7833個，而牛筋草根際土壤細菌的OTUs數最少，為7374個。

表1 河岸緩沖帶濕地建群種植物根際土壤細菌有效序列及OTUs數

由表2可知，3種建群種植物根際土壤細菌群落Chao1指數和Shannon指數有明顯的差異，其中荻草根際土壤樣品的Chao1指數和Shannon指數均為最高，分別為6288.59和11.04，其次是白茅根際土壤樣品的，其值分別為6004.55和10.76，而牛筋草根際土壤樣品的Chao1指數和Shannon指數均為最低，其值分別為5550.80和10.46。

表2 河岸緩沖帶濕地建群種草本植物根際土壤細菌Alpha多樣性

2.2 河岸緩沖帶濕地建群種植物根際土壤細菌群落結構組成

通過對測序結果的物種注釋，從3種植物根際土壤樣品中共測得28門、87綱、168目、296科、696屬土壤細菌。由圖1可知，各植物根際土壤細菌群落組成均以變形菌門(Proteobacteria，45.34%~48.83%)、酸桿菌門(Acidobacteria，20.06%~ 22.69%)為主，其次為相對豐度較高的放線菌門(Actinobacteria，5.30%~7.56%)、厚壁菌門(Firmicutes，2.82%~8.07%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，3.10%~4.19%)、綠彎菌門(Chloroflexia，3.15%~3.60%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，2.34%~5.06%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae，0.56%~1.06%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，0.40% ~ 0.82%)。

圖1 河岸緩沖帶濕地建群種植物根際土壤門水平群落結構

圖2 河岸緩沖帶濕地建群種植物根際土壤綱水平群落結構

河岸緩沖帶濕地各建群種植物根際土壤細菌群落結構在門水平上存在差異。土壤變形菌門相對豐度最高的是荻草根際土壤樣品，牛筋草根際土壤樣品的最低。土壤酸桿菌門相對豐度最高的是牛筋草根際土壤樣品，白茅根際土壤樣品的最低。土壤放線菌門相對豐度最高的是白茅根際土壤樣品，牛筋草根際土壤樣品的最低。土壤厚壁菌門相對豐度最高的是牛筋草根際土壤樣品，荻草根際土壤樣品的最低。土壤擬桿菌門相對豐度最高的是荻草根際土壤樣品，荻草根際土壤樣品的最低。土壤綠彎菌門相對豐度最高的是牛筋草根際土壤樣品，荻草根際土壤樣品的最低。土壤硝化螺旋菌門相對豐度最高的是荻草根際土壤樣品，白茅根際土壤樣品的最低。

從綱水平來看，3種植物根際土壤細菌菌群均以α-變形菌綱(Alphaproteobacteria, 15.25%~18.21%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria, 13.86%~16.77%)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria, 6.61%-9.78%)為優勢菌綱，其他相對豐度較高的菌綱有放線菌綱(Actinobacteria, 5.10%~7.36%)、δ-變形菌綱(Deleaproteobacteria, 5.01%~6.55%)、芽孢桿菌綱(Bacilli，2.18%~4.94%)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes，2.23%~4.94%)。α-變形菌綱的相對豐度以牛筋草根際土壤樣品的最高，以荻草根際土壤樣品的最低。β-變形菌綱相對豐度以荻草根際土壤樣品的最高，以白茅根際土壤樣品的最低。γ-變形菌綱相對豐度以牛筋草根際土壤樣品的最高，以荻草根際土壤樣品的最低。放線菌綱的相對豐度以白茅根際土壤樣品的最高，以牛筋草根際土壤樣品的最低。δ-變形菌綱相對豐度以白茅根際土壤樣品的最高，以牛筋草根際土壤樣品的最低。芽孢桿菌綱和芽單胞菌綱的相對豐度均以牛筋草根際土壤樣品的最高，以荻草根際土壤樣品的最低。

3 結論與討論

（1） 在濕地生態系統中，微生物種群的多樣性對濕地系統生態平衡的維持具有重要作用［10］。濕地土壤微生物群落多樣性指數越高，濕地生態系統的水質凈化功能也越強［11］。本研究河岸緩沖帶濕地3種建群種植物根際土壤細菌群落Chao1指數和Shannon指數有明顯的差異，以荻草根際土壤樣品的Chao1指數和Shannon指數為最高，說明在鰲江流域河岸緩沖帶濕地中禾本科植物荻草對河流水質的提高以及對緩沖帶濕地的生態修復和保護均具有重要的作用。

（2） 浙江省鰲江小頭段河岸緩沖帶濕地3種建群種植物根際土壤細菌群落具有較高的多樣性，共測得28門、87綱、168目、296科、696屬土壤細菌。在門水平上主要的細菌菌群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門以及未分類的菌門。在綱水平上主要的細菌菌群有α-變形菌綱、β-變形菌門綱、γ-變形菌綱、放線菌綱、δ-變形菌門綱、芽孢桿菌綱、芽單胞菌綱等。說明該河段河岸緩沖帶濕地土壤細菌種類豐富，這對維持河流系統生態平衡具有重要作用。各植物根際土壤細菌在門水平上的菌群以變形菌門和酸桿菌門為主，兩者占總測序序列的65.40%~71.52%，這一結果與房昀昊等［8］有關濕地土壤微生物的研究結果相一致。變形菌門具有較強的脫氮除磷作用［12］，本研究以荻草根際土壤樣品的相對豐度最高，說明荻草在緩沖帶濕地脫氮除磷方面可能發揮著重要作用。酸桿菌門能參與枯枝落葉分解的碳循環［13］，本研究以牛筋草根際土壤樣品的相對豐度最高，說明牛筋草根際土壤環境有利于碳的循環轉化。綠彎菌門參與了環境中 C、N、S等一系列重要元素的生物地球化學循環過程［14］，本研究中綠彎菌門的相對豐度以牛筋草根際土壤樣品的最高，說明該植物在降解河流污染物方面能夠發揮重要作用。硝化螺旋菌在好氧條件下能夠把亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，在氮循環中發揮著重要作用，本研究中該菌門相對豐度以荻草根際土壤樣品的最高，說明荻草更能促進該區域生態系統的氮循環。