基于核酸適配體和量子點的胃癌靶向成像研究

孫詩涵，馬一諾，王群，李鑫，巴微，李婉明

（中國醫科大學衛生健康委員會細胞生物學重點實驗室，醫學細胞生物學教育部重點實驗室，生命科學學院分子細胞生物學教研室，沈陽 110122）

胃癌是全球范圍內常見癌癥之一，通過遺傳和表觀遺傳改變的積累而發展，分子改變在癌前病變發展前就已發生［1］，致使胃癌通常在晚期才被確診，死亡率極高［2］。目前，胃癌的發現和診斷仍高度依賴于內鏡檢查［3］、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）［4］、正電子發射計算機斷層顯像（positron emission computed tomography，PET）等影像學檢查方法，由于這些方法的特異度與靈敏度較低，對腫瘤的早期診斷難以實現。隨著新的腫瘤標志物不斷被發現以及檢測方法不斷創新，熒光成像成為了癌癥靶向成像的工具之一，最終有望實現腫瘤早期診斷。核酸適配體是一種短的單鏈核酸（ssDNA或RNA），在針對腫瘤的分子成像研究中是一類理想的成像探針。量子點（quantum dots，QD）也被稱為納米級半導體晶體［5］，可以長時間對標志物進行穩定觀察。

本研究基于W3以及QD的多種特性，將兩者偶聯制備探針，用于針對胃癌細胞的靶向成像，并探討其應用于臨床的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和主要試劑：胃腺癌細胞系SGC-7901、正常人胃黏膜上皮細胞GES-1購自上海中科院細胞庫，鏈霉親和素標記的QD605購自QD-SA，武漢珈源量子點技術有限公司，胰蛋白酶及胎牛血清購自美國HyClone公司，RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司，BSA購自中國Biosharp公司，鯡魚精DNA購自德國Sigma公司，Cell-TrackerTMGreen CMFDA購自美國Invitrogen公司，DAPI購自中國Tiangen公司，核酸適配子W3序列和原文庫購自美國Library，W3篩選時的隨機寡核苷酸文庫和序列購自中國上海生工生物公司。

1.1.2 實驗動物：4周齡健康雌性BALB/c裸鼠購自中國北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.3 組織標本：選取中國醫科大學附屬第一醫院經病理學確診、術前未行放化療的胃癌患者的癌旁組織和癌組織。本研究獲得我校醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：SGC-7901和GES-1細胞均用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱中進行培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 核酸適配體的前處理：將合成的W3或 Library 溶于結合緩沖液（PBS+10%BSA+1%鯡魚精DNA）中，95 ℃加熱變性 5 min，然后置于冰上10 min，于-20 ℃中保存待用。

1.2.3 流式細胞術檢測W3-QD探針對不同細胞系的結合情況：取對數生長期GES-1細胞與SGC-7901細胞，利用EDTA消化，制備單細胞懸液。加入終濃度為250 nmol/L的FAM-W3或FAM-Library，與細胞4 ℃孵育30 min；1 000 r/min離心5 min，棄去上清；加入QD-SA室溫孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，加入300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞的熒光信號。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察W3-QD探針對細胞的靶向成像：利用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期的SGC-7901細胞和GES-1細胞并吹打成單細胞懸液，細胞計數后接種于內置蓋玻片的6孔板中，過夜培養。加入 Biotin-W3（終濃度為250 nmol/L），分別與上述2種細胞4 ℃孵育30 min；加入 QD-SA（1 ∶200稀釋）室溫孵育20 min；DAPI復染細胞核5 min；熒光顯微鏡觀察并拍照。

取對數生長期的GES-1細胞，加入Cell-tracker（綠色，1 ∶1 000稀釋）37 ℃孵育30 min，并吹打成單細胞懸液；取對數生長期 SGC-7901細胞并吹打成單細胞懸液；細胞計數后取活染成綠色的GES-1細胞與SGC-7901細胞以1 ∶1進行混合，混勻后接種于6孔板中（內置蓋玻片）過夜培養。如上述步驟進行W3-QD的標記。

取對數生長期的SGC-7901細胞，消化吹打成單細胞懸液，均勻接種于6孔板的2孔中（內置蓋玻片）過夜培養；分別加入FAM-W3和W3-QD如上述步驟進行標記，并于第0天和第7天觀察染色結果。

1.2.5 荷瘤裸鼠模型的建立：4周齡雌性BALB/c裸鼠在SPF級條件下飼養。取對數生長期SGC-7901細胞，胰酶消化，細胞數濃度調整為1×107/mL。裸鼠右前腋下經皮下注射200 μL 細胞懸液，觀察腫瘤的生長情況。4周后取出腫瘤塊。

1.2.6 W3-QD探針對胃癌組織的特異性標記：裸鼠皮下移植瘤和臨床患者病理組織常規包埋后制備成厚度為 5 μm 的石蠟切片，60 ℃烤片4 h。100%二甲苯脫蠟2次，15 min/次；梯度入水，100%乙醇2次，10 min/次，95%、90%、85%、75%和50%乙醇各5 min；PBS清洗3次，5 min/次；切片置于0.01 mol/L 枸椽酸鈉修復液中高壓修復100 s，自然冷卻至室溫；PBS洗3次，5 min/次；加入封閉液（洗滌緩沖液+1%BSA+10%FBS）4 ℃封閉60 min；PBS 洗滌2次后加入Biotin-W3或Biotin-Library，終濃度為250 nmol/L，4 ℃孵育60 min；PBS 洗滌2次后，加入QD-SA室溫孵育20 min；PBS 洗滌后熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 核酸適配體W3與SGC-7901細胞的特異性結合

流式細胞術結果顯示，適配體W3與SGC-7901細胞孵育后的熒光結合峰明顯右移，與之相比，與GES-1細胞孵育后的熒光結合峰沒有明顯移動，提示核酸適配體W3能夠與SGC-7901細胞發生結合，而與GES-1細胞不結合。見圖1。

2.2 W3-QD探針對SGC-7901細胞的靶向成像

熒光顯微鏡結果顯示，與W3-QD探針孵育后，SGC-7901細胞表面能觀察到明顯的特異性紅色熒光，而GES-1細胞表面沒有觀察到任何熒光信號（圖2），表明W3-QD探針可以實現胃癌細胞的靶向成像。

2.3 W3-QD探針對混合培養細胞中胃癌細胞SGC-7901的靶向成像

為了確定W3-QD具有對靶細胞的特異性識別能力，利用Cell-tracker活體熒光染料對GES-1正常細胞進行活細胞染色，再將染色后的細胞與SGC-7901胃癌細胞進行混合培養24 h。之后對混合細胞用W3-QD進行識別檢測，熒光顯微鏡結果顯示，被染色后的GES-1細胞表面沒有識別到熒光信號，但胃癌細胞SGC-7901的細胞膜表面可以特異性地識別紅色熒光信號（圖3），表明在與正常細胞混合培養的情況下，W3-QD探針仍然保持其對胃癌細胞的特異性，能夠對胃癌細胞實現靶向成像。

圖3 W3-QD探針對混合培養細胞中SGC-7901靶向成像的熒光顯微鏡成像圖Fig.3 Fluorescence microscope image of targeting SGC-7901 in mixed culture cells by W3-QD probe

2.4 QD探針具有更高的靈敏度和光穩定性

為了探究QD對靶細胞的靈敏度和光穩定性，對SGC-7901細胞進行FAM-W3和W3-QD的識別檢測，使其表面分別帶有特異性綠色熒光和紅色熒光。并分別于第0天和第7天觀察染色結果，相較于FAM-W3，W3-QD探針能識別更多的胃癌細胞，具有更高的靈敏度；而且在第7天時仍有大面積紅色熒光被保留下來，但綠色熒光幾乎全部淬滅（圖4）。以上結果表明，QD相較于有機染料對靶細胞的成像具有更高的靈敏度和光穩定性。

圖4 W3-QD和FAM-W3對SGC-7901靶向成像的熒光顯微鏡檢測Fig.4 Fluorescence microscopy detection of SGC-7901 targeting imaging by W3-QD and FAM-W3

2.5 W3-QD探針對荷瘤裸鼠腫瘤組織的靶向成像

在細胞水平上，W3-QD探針可以對特定的腫瘤細胞系靶向成像已被證實，下一步為了驗證W3-QD探針對體內環境下的腫瘤細胞能否靶向成像，建立了SGC-7901的荷瘤裸鼠模型，獲取腫瘤組織制備石蠟切片，進行W3-QD的識別。組織免疫熒光實驗結果顯示，與Library處理組相比，W3-QD探針處理的裸鼠皮下移植瘤組織能觀察到明顯的紅色熒光信號，表明W3-QD探針能夠對裸鼠皮下移植瘤組織進行靶向成像。見圖5。

圖5 Library-QD和W3-QD對胃癌組織靶向成像的熒光顯微鏡成像圖Fig.5 Fluorescence microscope image of Library-QD and W3-QD targeted imaging of gastric cancer tissue

2.6 W3-QD探針對臨床胃癌病理切片的靶向成像

為了驗證W3-QD探針對于臨床胃癌組織切片的靶向成像能力，利用W3-QD對臨床收集到的胃癌組織及癌旁組織進行特異性成像檢測。熒光顯微鏡觀察顯示，經過W3-QD探針處理組的癌旁組織觀察不到任何紅色熒光信號，而在腫瘤組織的切片上特異性紅色熒光信號清晰可見于腫瘤細胞的細胞膜表面；相比之下，經Library-QD進行標記時均無任何特異性熒光信號（圖6）。以上結果可以顯示W3-QD有優良的對胃癌靶向成像特異性。

圖6 W3-QD探針對胃癌病理切片的靶向成像圖Fig.6 Target imaging of W3-QD probe on pathological section of gastric cancer

3 討論

與傳統的醫學影像方法相比，分子影像技術特異識別腫瘤相關標志物的靶向分子，對腫瘤的早期診斷更精準。單克隆抗體作為針對胃癌的靶向分子，已經相對成熟，但其仍存在著諸多缺點，如高免疫原性，在人體內清除時間長，可檢測的靶標有限等。

核酸適配體是一種新型的分子標志物及靶向配體，能夠折疊成特定的三維結構，對靶標分子具有很高的親和力［6］和特異性［7］。與抗體相比，核酸適配體具有高特異性［8-9］、低免疫原性［10］、低成本、易修飾［11］、結構穩定、快速組織滲透性等優點，在現實使用中功能更為優越。QD在紫外光激發下可發出不同波長的熒光。相較于傳統有機熒光染料，QD尺寸?。?2-13］，且具有獨特的光學性質如高光漂白穩定性［14］、熒光間歇性［15］和寬而連續的激發光譜，更有利于成像檢測。本研究將QD與適配體結合使用，并與傳統染色方法做對比。前期研究［16］顯示多種轉移性腫瘤細胞可以被適配體W3特異性識別出來，并用于對具有轉移潛能的腫瘤細胞實現靶向成像。

ZENG等［17］利用靶向CD30的適配體對淋巴瘤組織進行免疫染色，發現CD30適配體比CD30抗體具有更高的靈敏度和特異度。本研究利用前期Cell-SELEX篩選獲得的核酸適配體W3作為靶向成像分子探針，首先在細胞水平上實現了胃癌細胞的靶向成像，并且在混合細胞中也能夠特異性識別胃癌細胞；其次在組織水平上對裸鼠體內皮下移植瘤的胃癌細胞具有良好的靶向成像功能。進一步探討臨床胃癌組織的成像情況，發現核酸適配體W3具有良好的腫瘤特異性，有可能成為胃癌診斷的靶向成像分子探針。

本研究基于QD的優良特性和核酸適配體的靶向性，構建的W3-QD探針，實現了胃癌細胞的靶向成像，且7 d后與FAM-W3探針相比，W3-QD探針的熒光仍有良好的穩定性，具有更優良的實際應用價值。免疫組化是應用最廣泛的對臨床樣本成像的方法，但其仍受到一定的限制［18］，QD可以在一定程度上替代傳統的免疫組化成像，應用到諸如癌癥診斷、發病機制研究、治療、分子病理學和癌癥生物標志物結合的異質性等方面。本研究采用QD進行成像檢測，有利于對靶標進行長時間而穩定的觀察。

綜上所述，以核酸適配體W3偶聯QD制備量子點探針W3-QD，實現胃癌細胞系和臨床胃癌組織的靶向成像，有可能為胃癌的早期診斷提供新的分子工具。