漢防己甲素降低大鼠血尿酸水平的機制研究

吳曙智 葛朝洪 梅傳州 陳連國 鐘優艷

[摘要]?目的?探討漢防己甲素對高尿酸血癥大鼠血尿酸（uric?acid，UA）的影響。方法?將40只SPF級別雄性大鼠按照隨機數字表法分成空白對照組、高尿酸血癥模型組、別嘌醇模型組、漢防己甲素低劑量模型組和漢防己甲素高劑量模型組，每組8只。用腺嘌呤（200mg/kg）與氧嗪酸鉀（250mg/kg）聯合飼喂酵母飼料（10g/kg）的方法構建高尿酸血癥的大鼠模型，空白對照組喂普通飼料。造模成功后，從第8天起，每天下午給予別嘌呤模型組大鼠灌胃別嘌呤醇（40mg/kg），漢防己甲素低劑量模型組、漢防己甲素高劑量模型組分別灌胃16mg/kg和32mg/kg漢防己甲素，空白對照組與高尿酸血癥模型組灌胃同等體積的生理鹽水。給藥后每周采集大鼠血液檢測UA、血肌酐（serum?creatinine，Scr）及血尿素氮（blood?uric?nitrogen，BUN）水平，處死后取肝臟檢測黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，XOD）和腺苷脫氨酶（adenosine?deaminase，ADA）活性。結果?干預1周時，除空白對照組外，各組UA水平均顯著升高（P<0.05），造模成功。與高尿酸血癥模型組相比，干預2周、3周、4周時，低劑量漢防己甲素組的UA、Scr和BUN水平差異均無統計學意義（P>0.05）；干預4周時，高劑量漢防己甲素模型組的UA水平顯著降低（P<0.05）。干預3周、4周時，高劑量漢防己甲素模型組Scr水平均顯著降低（P<0.05），干預2周時，高劑量漢防己甲素模型組的BUN水平顯著降低（P<0.05）。與高尿酸血癥模型組相比，高劑量漢防己甲素模型組XOD活性顯著降低（P<0.05），低劑量漢防己甲素模型組、高劑量漢防己甲素模型組ADA活性均顯著降低，差異無統計學意義（P>0.05）。結論?漢防己甲素對高尿酸血癥大鼠有改善效果，可能的機制是其對黃嘌呤氧化酶活性的抑制，但其具體作用機制有待進一步研究。

[關鍵詞]?漢防己甲素；高尿酸血癥；血尿酸；黃嘌呤氧化酶

[中圖分類號]?R589??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.005

Study?on?the?mechanism?of?tetrandrine?to?reduce?blood?uric?acid?level?in?rats

WU?Shuzhi1，?GE?Chaohong2，?MEI?Chuanzhou2，?CHEN?Lianguo2，?ZHONG?Youyan3

1.Department?of?Neurology，?Wenzhou?Peoples?Hospital，?Wenzhou?325000，?China;?2.Department?of?Pharmacy，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Wenzhou?Medical?University，?Wenzhou?325000，?China;?3.Department?of?Pharmacy，?Wenzhou?Peoples?Hospital，?Wenzhou?325000，?China

[Abstract]?Objective?To?study?the?effect?of?tetrandrine?on?serum?uric?acid?（UA）?in?hyperuricemia?rats.?Methods?A?total?of?40?SPF-rated?male?rats?were?divided?into?blank?control?group，?hyperuricemia?model?group，?hyperuricemia?model?with?allopurinol?group，?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?low-dose?group?and?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?according?to?random?number?table?method，?with?8?rats?in?each?group.?The?rat?model?of?hyperuricemia?was?constructed?by?feeding?adenine?（200mg/kg）?with?potassium?oxyzincate?（250mg/kg）?in?combination?with?yeast?diet?（10g/kg），?while?the?blank?control?group?was?fed?with?normal?diet.?From?day?8?onwards，?the?rats?were?given?allopurinol?（40mg/kg）?by?gavage?in?the?afternoon?every?day，?16mg/kg?and?32mg/kg?of?tetrandrine?in?the?low-dose?model?group?and?high-dose?model?group?respectively，?and?the?same?volume?of?saline?in?the?blank?control?group?as?in?the?hyperuricemia?model.?After?administration，?blood?was?collected?weekly?from?the?rats?to?test?the?levels?of?blood?UA，?serum?creatinine?（Scr）?and?blood?urea?nitrogen?（BUN），?and?liver?was?taken?after?execution?to?test?the?activities?of?xanthine?oxidase?（XOD）?and?adenosine?deaminase?（ADA）.?Results?After?1?week?of?intervention，?UA?levels?were?significantly?higher?in?all?groups?except?the?blank?control?group?（P<0.05），?and?modelling?was?successful.?There?was?no?statistically?significant?difference?in?UA，?Scr?and?BUN?levels?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?low-dose?group?at?2?weeks，?3?weeks?and?4?weeks?of?intervention?compared?to?the?hyperuricemia?model?group?（P>0.05）.?At?4?weeks?of?intervention，?UA?levels?were?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?（P<0.05）.?At?3?and?4?weeks?of?intervention，?the?Scr?level?was?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?（P<0.05）.?At?2?weeks?of?intervention，?BUN?levels?were?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?（P<0.05）.?XOD?activity?was?significantly?lower?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group?compared?to?the?hyperuricemia?model?group?（P<0.05）.?The?ADA?activity?was?significantly?reduced?in?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?low-dose?group?and?the?hyperuricemia?model?with?tetrandrine?high-dose?group，?and?the?differences?were?not?statistically?significant?（P>0.05）.?Conclusion?The?ameliorative?effect?of?tetrandrine?on?hyperuricemia?rats.?The?possible?mechanism?for?the?improvement?of?hyperuricemia?in?rats?is?the?inhibition?of?xanthine?oxidase?activity，?but?the?exact?mechanism?of?action?needs?to?be?further?investigated.

[Key?words]?Tetrandrine;?Hyperuricemia;?Blood?uric?acid;?Xanthine?oxidase

高尿酸血癥是導致痛風的主要原因，主要的發病機制是血尿酸（uric?acid，UA）生成增加或排泄減少[1-2]。治療高尿酸血癥的藥物主要有抑制尿酸生成藥物（別嘌呤醇等）、促進尿酸溶解藥物（拉布立酶等）、降低尿酸藥物（氯沙坦等）、促進尿酸排泄藥物（苯溴馬隆等）[3-4]。目前，一線常用降尿酸藥物如別嘌呤醇和丙磺舒，長期使用容易引起肝腎損害[5]、超敏反應、遲發性過敏反應以及嚴重的皮疹等[6]。因此，尋找更安全有效的降尿酸藥物成為研究者的關注點之一。中藥治療高尿酸血癥的研究逐步受到關注[7]。漢防己甲素具有多種藥理作用[8-9]，研究發現漢防己甲素能夠降低SD大鼠血液中尿酸[10]。考慮到漢防己甲素具有消腫、鎮痛、抗關節炎等作用，可能是一種潛在的降尿酸藥物。因此，本研究通過建立大鼠高尿酸血癥模型來探討漢防己甲素的降尿酸作用。

1??材料與方法

1.1??實驗動物

實驗動物清潔級SD雄性大鼠，體重（200±20）g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0020；動物倫理號：wydw2022-0080]。40只實驗大鼠適應性飼養7d，實驗室溫度為（25±2）℃，濕度為（55±5）%，每天12h光照交替。采用隨機數字表法分為空白對照組、高尿酸血癥模型組、別嘌醇模型對照組、漢防己甲素高劑量模型組和漢防己甲素低劑量模型組，每組8只。4個模型組每天上午用腺嘌呤（200mg/kg）與氧嗪酸鉀（250mg/kg）溶于聚乙二醇后的溶液灌胃并聯合酵母飼料（10g/kg）飼喂1周來構建高尿酸血癥大鼠模型，空白對照組喂普通飼料并每天上午灌胃等量聚乙二醇。第8天開始，4組酵母飼料灌胃組每天上午繼續灌胃腺嘌呤與氧嗪酸鉀，下午給予別嘌呤模型組灌胃40mg/kg的別嘌呤醇（溶于生理鹽水），漢防己甲素低劑量和高劑量模型組分別灌胃16mg/kg和32mg/kg漢防己甲素（溶于生理鹽水）；空白對照組與高尿酸血癥模型組灌胃同等體積的生理鹽水。連續給藥21d，每周測量1次體質量并進行尾靜脈取血，全血離心取血清存于–80℃冰箱待檢。最后1周將大鼠處死，取肝臟，于液氮速凍后存于–80℃待測。

1.2??儀器與試劑

主要試劑：漢防己甲素（貨號：F-001-20g）和別嘌醇（貨號：A7690）分別購于成都瑞芬思生物科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司，腺嘌呤（貨號：A6279-100g）和氧嗪酸鉀（貨號：P137112-100g）分別購于上海麥克林生化科技有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司，20%含量的酵母飼料購買于江蘇美迪森生物醫藥有限公司。

主要儀器和耗材：大鼠灌胃針、高速離心機（型號5804R）、冰箱、電子天平及全自動生化分析儀（型號AU5831）。南京建成生物工程研究所的檢測腺苷脫氨酶（adenosine?deaminase，ADA）試劑盒（A048-2-1，96T），Solarbio的黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，XOD）活性檢測試劑盒（貨號：BC1095）。

1.3??方法

1.3.1??血液指標監測??造模后每周大鼠尾靜脈取血（取血前12h禁食但不禁水），3500轉/min，離心10min，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血中UA、血肌酐（serum?creatinine，Scr）、血尿素氮（blood?urea?nitrogen，BUN）水平。

1.3.2??臟器酶活性檢測??取0.10～0.15g肝臟，按照組織質量（g）∶試劑體積（ml）=1∶10進行混合，用玻璃勻漿器進行冰浴勻漿，在4℃條件下，8500轉/min，離心10min，取上清液置于冰上待測。

1.3.3??黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，XOD）活性檢測??按照XOD活性檢測試劑盒測定步驟操作，將離心后的上清液樣本和檢測試劑混勻，37℃水浴/恒溫培養箱放置20min，于96孔板中，測定530nm處吸光度，并按樣本蛋白濃度計算酶活。XOD活性（U/mg?prot）=（?A樣本÷?A標準×C標）×1000×V樣÷（Cpr×V樣）÷T×F=12.5×?A樣本÷?A標準÷Cpr×F。其中，單位（U/mg?prot）的定義為每毫克組織蛋白每分鐘催化產生1nmol?NO2-定義為一個酶活力單位。另外，?A樣本=A測定－A空白，?A標準=A標準－A空白，C標為標準溶液亞硝酸鈉的濃度（10μmol/ml），T為反應時間（20min），Cpr為樣本蛋白濃度（mg/ml），F為稀釋倍數。

1.3.4??腺苷脫氨酶（adenosine?deaminase，ADA）活性檢測??然后按照ADA試劑盒測定步驟操作，將離心后的上清液樣本和檢測試劑混勻，37℃水浴/恒溫培養箱放置7min，于96孔板中546nm處連續2min吸光度值的變化，計算?A/min，并按樣本蛋白濃度計算酶活：組織ADA活性（U/g?prot）=（?A測定–?A空白）÷（?A標準-?A空白）×C標÷Cpr。其中，C標為標準溶液腺苷脫氨酶的濃度（38.6U/L），Cpr為樣本蛋白濃度（g/L）。

1.4??統計學方法

采用SPSS?18.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??造模后體質量變化情況

在實驗過程中，各組均出現大鼠死亡的現象，對照組1例，各模型組均2例。剔除所有死亡大鼠的數據指標，各組取6只大鼠進行后續統計分析。造模后，除對照組外，各模型組大鼠的體質量都有不同程度的減輕，見圖1。

2.2??UA水平比較

干預1周時，除空白對照組外，各組UA水平均顯著升高（P<0.05），造模成功。與高尿酸血癥模型組相比，干預2周時，別嘌呤醇模型組的UA水平降低，但差異無統計學意義（P>0.05）；干預3周、4周時，別嘌呤醇模型組的UA水平顯著降低（P<0.05）；干預2周、3周、4周時，低劑量漢防己甲素組的UA水平與高尿酸血癥模型組相比，差異均無統計學意義（P>0.05），干預4周時，高劑量漢防己甲素模型組的UA水平顯著降低（P<0.05），見表1。

2.3??Scr和BUN水平比較

各組大鼠初始（第0周）各組Scr和BUN水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。干預1周時，與空白對照組相比，各組Scr和BUN水平均顯著升高（P<0.05）。與高尿酸血癥組相比，干預2周、3周、4周時，別嘌呤醇模型組的Scr水平均顯著降低（P<0.05）；干預3周、4周時，高劑量漢防己甲素模型組Scr水平均顯著降低（P<0.05）；干預2周時，高劑量漢防己甲素模型組的BUN水平顯著降低（P<0.05）。干預2周、3周、4周時，低劑量漢防己甲素組的Scr和BUN水平與高尿酸血癥模型組相比，差異均無統計學意義（P>0.05），見表2、3。

2.4??XOD、ADA活性比較

高尿酸血癥模型組大鼠的XOD、ADA活性均顯著高于空白對照組（P<0.05）。與高尿酸血癥模型組相比，別嘌呤醇模型組大鼠的XOD、ADA活性均顯著降低（P<0.05），高劑量漢防己甲素組XOD活性顯著降低（P<0.05），高劑量漢防己甲素組ADA活性低于高尿酸血癥模型組，差異無統計學意義（P>0.05）；低劑量漢防己甲素組大鼠XOD、ADA活性與高尿酸血癥模型組相比，差異均無統計學意義（P>0.05），見圖2、3。

3??討論

高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂導致尿酸含量升高從而引發的疾病。UA水平偏高與多種疾病有關，已成為威脅患者健康的重要影響因素之一。UA的生成和排泄這兩個復雜的代謝過程與其發病有關，而發病的機制可能與嘌呤代謝特異性酶活性的異常或缺失有關[11-12]。中醫藥具有安全性高、療效好等優點，目前已經成為高尿酸血癥的治療研究熱點之一[13]。

本研究中的高尿酸血癥大鼠造模方法主要參考石慧等[14]的文獻，采用酵母膏（10mg/kg）飼料喂養，結合腺嘌呤（100mg/kg）灌胃給藥聯合氧嗪酸鉀（300mg/kg）間隔（第1、3、7天）腹腔注射的方案誘導高尿酸血癥大鼠模型。該方案可在短期內安全誘導高尿酸血癥大鼠模型，模型效果持續時間較長。為了方便給藥，本研究在此基礎上，每天上午給予大鼠灌胃含200mg/kg腺嘌呤及300mg/kg氧嗪酸鉀的混合溶液，結合酵母膏（10mg/kg）飼料喂養的造模方案來構建本研究所需的高尿酸血癥模型大鼠。但200mg/kg腺嘌呤及300mg/kg氧嗪酸鉀在生理鹽水中溶解性差，靜置易沉淀，聚乙二醇可以親水又有一定的親脂性，是很好的溶劑和增溶劑，因此本研究選擇腺嘌呤（200mg/kg）與氧嗪酸鉀（250mg/kg）溶于聚乙二醇中灌胃并聯合酵母飼料（10mg/kg酵母）喂養的方式來構建高尿酸血癥大鼠模型。本研究結果顯示，造模1周后，除空白對照組外，各組大鼠UA明顯升高，說明模型造模成功，且整個實驗過程中大鼠死亡例數在可接受范圍（2/8）。

另外，本研究結果顯示，與高尿酸血癥組相比，各模型組大鼠的Scr和BUN水平顯著升高，說明該造模方法對大鼠的腎臟造成了一定損害，與石慧等[14]的報道一致。本研究結果顯示，XOD及ADA活性檢測結果顯示，高劑量的漢防己甲素能顯著抑制XOD的活性，對ADA活性可能也具有一定的效應，且對Scr也有一定的調節作用，說明其可用于降低尿酸水平。究其原因，可能是漢防己甲素作為天然活性成分，影響嘌呤代謝中XOD的活性，從而抑制尿酸的生成，調控尿酸鹽轉運蛋白，促進腎臟排泄尿酸，改善高尿酸血癥所致的腎損傷[15]。

綜上所述，漢防己甲素對大鼠高尿酸血癥有一定的治療作用，具有潛在的藥用價值，下一步計劃漢防己甲素對肝臟XOD等關鍵酶活性的具體影響進行深入研究。

[參考文獻][1] 繆建春，?楊泰源，?彭煒，?等.?萆薢車前茯苡湯對高尿酸血癥大鼠血尿酸及黃嘌呤氧化酶的影響[J].?中國醫院用藥評價與分析，?2016，?16（9）：?1166–1168.

[3] 孫珊珊，?曲連悅，?杜榮蓉，?等.?高尿酸血癥藥物治療研究進展[J].?中國臨床藥理學與治療學，?2019，?24（5）：?589–594