丙泊酚對腎母細胞瘤細胞遷移、侵襲及AMPK/ mTOR/4EBP1通路的影響

王紅梅 劉巖 劉俊江趙鑫

[摘要]?目的?研究丙泊酚對人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞遷移、侵襲的影響以及作用機制。方法?對人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞采用不同濃度（0、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）丙泊酚進行干預，藥物處理48h，采用MTT法進行篩選后，以5μg/ml丙泊酚作為后續實驗劑量。按照AMPK抑制劑Compound?C和丙泊酚給藥情況，分為空白對照組（C組）、10μmol/L?Compound?C組（I組）、5μg/ml丙泊酚組（P1組）和10μmol/L?Compound?C+5μg/ml丙泊酚組（P2組）。采用Transwell法評估SK-NEP-1細胞遷移和侵襲能力，采用蛋白質免疫印跡法檢測AMPK、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）和4EBP1及其磷酸化蛋白的表達。結果?P1組穿過細胞數和遷移細胞數顯著少于C組（P<0.05）；比較C組、I組、P2組的穿過細胞數和遷移細胞數，差異均無統計學意義（P>0.05）。與C組相比，P1組中p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著上調，且p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達顯著下調（P<0.05）。C組、I組、P2組各蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論?丙泊酚可以抑制腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞遷移和侵襲，其機制可能與激活AMPK/mTOR/4EBP1信號通路有關。

[關鍵詞]?丙泊酚；腎母細胞瘤；遷移和侵襲；AMPK/mTOR

[中圖分類號]?R737.11??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.021

Effect?of?propofol?on?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?cells?and?AMPK/mTOR/4EBP1?pathway

WANG?Hongmei1，?LIU?Yan2，3，?LIU?Junjiang1，?ZHAO?Xin1

1.The?First?Clinical?Medical?College?of?Mudanjiang?Medical?University，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China;?2.Department?of?Anesthesiology，?Hengqin?Hospital?of?Zhuhai?Peoples?Hospital，?Zhuhai?519000，?Guangdong，?China;?3.Department?of?Anesthesiology，?Hongqi?Hospital?Affiliated?to?Mudanjiang?Medical?University，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?impact?and?mechanism?of?propofol?on?the?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells?and?the?mechanism?of?action.?Methods?Intervention?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells?with?different?concentrations?（0，?1μg/ml，?2μg/ml，?5μg/ml，?10μg/ml，?20μg/ml）?of?propofol，?drug?treatment?for?48h?and?screening?by?MTT?method?followed?by?5μg/ml?of?propofol?as?the?subsequent?experimental?dose.?The?SK-NEP-1?cells?were?divided?into?blank?control?group?（group?C），?10μmol/L?Compound?C?group?（group?I），?5μg/ml?propofol?group?（group?P1）?and?10μmol/L?Compound?C+5μg/ml?propofol?group?（group?P2）?according?to?the?administration?of?the?AMPK?inhibitor?Compound?C?and?propofol.?The?migratory?and?invasive?ability?of?SK-NEP-1?cells?was?assessed?by?Transwell?assay?and?the?expression?of?AMPK，?mammalian?target?of?rapamycin?（mTOR）?and?4EBP1?and?their?phosphorylated?proteins?were?detected?by?Western?blot.?Results?The?number?of?crossing?cells?and?migrating?cells?in?group?P1?was?significantly?less?than?that?in?group?C?（P<0.05）.?Compared?the?number?of?crossing?cells?and?migrating?cells?in?groups?C，?I?and?P2，?the?differences?were?not?statistically?different?（P>0.05）.?Compared?with?group?C，?the?expression?of?p-AMPK/AMPK?protein?was?up-regulated?and?the?expression?of?p-mTOR/mTOR?protein?and?p-4EBP1/4EBP1?protein?were?down-regulated?in?group?P1，?and?the?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）.?Compared?the?expression?levels?of?each?protein?in?group?C，?group?I?and?group?P2，?the?differences?were?not?statistically?significant?（P>0.05）.?Conclusion?Propofol?can?inhibit?the?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells，?and?its?mechanism?could?be?linked?to?the?activation?of?the?AMPK/mTOR/4EBP1?signal?pathway.

[Key?words]?Propofol;?Nephroblastoma;?Migration?and?invasion;?AMPK/mTOR

腎母細胞瘤是兒童時期常見的腎臟惡性腫瘤，該病以無癥狀腹部腫塊為典型表現[1]，近年來，由于現代外科技術、多種藥物化療和放療的配合使用，整體治療效果有了顯著提高，但是仍然存在部分病例預后不良，這與腫瘤細胞轉移、復發和放化療抵抗等有關[2]。丙泊酚作為小兒麻醉常用的靜脈麻醉藥，在腎母細胞瘤手術中應用廣泛。近年來研究發現，丙泊酚麻醉可減少手術切除后多種癌癥的復發和轉移，可在一定程度上延緩腫瘤發展的進程[3]，丙泊酚可抑制腎母細胞瘤細胞增殖活性并促進其凋亡[4]，但具體作用機制仍不明晰。AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）信號通路是近幾年的研究熱點，AMPK激活后可以通過多種分子機制誘導多種惡性腫瘤細胞的凋亡和增殖抑制。Wang等[5]發現非肌肉肌球蛋白ⅡA可通過在體外激活AMPK/mTOR途徑促進結直腸癌細胞的增殖和侵襲。Li等[6]發現丙泊酚可能通過調控AMPK信號途徑對HepG2細胞增殖及細胞周期具有抑制作用，并促使腫瘤細胞發生凋亡。在甲狀腺乳頭狀癌和肺癌等研究中發現，AMPK/mTOR/4EBP1信號途徑的活化與其腫瘤細胞的浸潤及增殖抑制有一定關系[7-8]。但目前對于丙泊酚是否通過調控AMPK/mTOR通路對腎母細胞瘤細胞侵襲和遷移影響的研究未見報道。因此，本文旨在探索丙泊酚對腎母細胞瘤細胞的侵襲及遷移及有關機制，為臨床上腎母細胞瘤手術中丙泊酚的應用提供新的實驗依據。

1??材料與方法

1.1??材料

人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；含有10%胎牛血清的McCoys?5A培養基購自武漢普諾賽生物有限公司；丙泊酚購自大連美侖生物有限公司（貨號：MB?1613-S）；DMSO及SDS-聚丙烯酰胺購自美國Sigma公司；AMPK、pAMPK及mTOR等抗體均購自美國Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海Beyotime?Biotechnology公司。

1.2??分組

將人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞于37℃條件下復蘇，然后將其懸浮于10%胎牛血清的McCoys?5A培養液中，于37℃及5%CO2環境中恒溫培養。將濃度為1×105/ml的SK-NEP-1細胞懸浮液接種在96孔板上，每個孔100μl。添加不同濃度丙泊酚（未添加丙泊酚、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）處理細胞48h，采用MTT法檢測丙泊酚對SK-NEP-1細胞活力的影響，結果表明，與未添加丙泊酚的細胞相比，采用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml丙泊酚干預的細胞，存活率變化不明顯，差異無統計學意義（P>0.05）；經10μg/ml、20μg/ml丙泊酚干預的細胞存活率均顯著降低且呈一定的濃度依賴性（P<0.05）。因此，本研究選用對SK-NEP-1細胞存活率無明顯作用的5μg/ml丙泊酚作為后續實驗劑量。相對細胞活力（%）=（實驗組吸光度值–空白組吸光度值）/（對照組吸光度值–空白組吸光度值）×100%，檢測波長490nm。按照AMPK抑制劑Compound?C和丙泊酚給藥情況，將符合實驗要求的SK-NEP-1細胞分為空白對照組（C組）、10μmol/L?Compound?C組（I組）、5μg/ml丙泊酚組（P1組）和10μmol/L?Compound?C+5μg/ml丙泊酚組（P2組）。

1.3??方法

1.3.1??SK-NEP-1細胞侵襲和遷移能力檢測??采用Transwell法檢測SK-NEP-1細胞遷移和侵襲能力。①侵襲實驗：各組以不同濃度丙泊酚干預48h后，對細胞進行收集，采用無血清McCoys?5A培養基重懸并進行細胞計數，調整細胞密度至1×105/ml后，接種到涂有Matrigel基質膠的Transwell上腔，下腔灌注10%胎牛血清McCoys?5A培養基，并確保沒有氣泡產生。培養48h后，用甲醇固定并采用結晶紫染色法處理下室細胞，在顯微鏡（×100）下觀察，隨機選取5個視野，計數每視野的細胞數并成像。②遷移實驗：上室不加Matrigel基質膠，余操作同侵襲實驗。

1.3.2??蛋白表達水平檢測??將各組細胞裂解離心后收集總蛋白，采用蛋白定量BCA法進行含量分析。將蛋白樣品經SDS-PAGE電泳法進行分離，并將其轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene?fluoride，?PVDF），封閉后與相應的一抗在4℃條件下孵育過夜。采用TBST緩沖鹽溶液清洗3次，洗去未結合一抗，將膜與二抗（山羊抗兔IgG?1：5000）雜交后，繼續孵育1h，然后再洗滌PVDF膜3次，10min/次，使用微機顯影儀進行曝光和顯影，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3-phosphate?dehydrogenase，GAPDH）作為內參量，采用Image?J軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.4??統計學方法

采用GraphPad?Prism?8.0.2軟件對本文對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。每個實驗均至少獨立重復進行3次。

2??結果

2.1??丙泊酚對SK-NEP-1細胞遷移和侵襲的影響

P1組穿過細胞數和遷移細胞數顯著少于C組（P<0.05）；C組、I組、P2組的穿過細胞數和遷移細胞數比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見圖1。

2.2??丙泊酚對AMPK、mTOR及4EBP1通路蛋白表達的影響

與C組相比，P1組中p-AMPK/AMPK蛋白表達上調，p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達下調，差異均有統計學意義（P<0.05）。C組、I組、P2組各蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見圖2。

3??討論

腎母細胞瘤是小兒常見的泌尿系統惡性腫瘤，目前臨床多采用以手術切除為主的多學科結合診療模式進行治療[9]。大多數腎母細胞瘤患者預后不佳是由于其高增殖、遷移和侵襲能力[10]。研究顯示，癌癥患者圍手術期的麻醉管理可以通過影響免疫系統、腫瘤血管生成和癌細胞的行為來影響腫瘤復發[11]。丙泊酚廣泛應用于兒科麻醉，具有鎮吐和術后譫妄發生率低等優點。多項體外研究表明，丙泊酚對結直腸癌、腎細胞癌、胃癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用[12-14]。回顧性研究表明，與應用揮發性麻醉藥相比，應用丙泊酚進行腫瘤外科手術的麻醉，能在一定程度上改善患者的生存率[15]，但目前其具體機制尚不完全清楚。

本研究結果顯示，在體外用丙泊酚干預SK-NEP-1細胞，用MTT實驗檢測SK-NEP-1細胞活性，與未添加丙泊酚細胞相比，采用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml丙泊酚干預的細胞，存活率變化不明顯，差異無統計學意義；經10μg/ml、20μg/ml丙泊酚干預的細胞存活率均顯著降低且呈一定的濃度依賴性，以上結果與之前丙泊酚的抗腫瘤作用報道相符[14]。本研究選用5μg/ml丙泊酚作為實驗劑量，Transwell實驗結果顯示5μg/ml丙泊酚顯著降低穿膜細胞數目和遷移數目，提示丙泊酚可以在一定程度上抑制SK-NEP-1細胞的遷移和侵襲。

AMPK/mTOR信號通路在腫瘤的遷移、侵襲、自噬和化療抵抗等腫瘤的發生、發展中起著重要作用。Song等[16]研究結果表明，ad-凋亡蛋白可能通過AMPK/mTOR信號途徑對人肺癌細胞的糖酵解、遷移和侵襲產生抑制作用。AMPK激活劑AICAR可通過調節AMPK/mTOR誘導細胞凋亡，減弱轉化生長因子-β誘導的細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化蛋白表達，并增強前列腺癌細胞對多西紫杉醇的化學敏感性[17]。Luan等[18]研究發現，TIPRL誘導AMPK的磷酸化，繼而減弱了mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化，從而導致mTOR信號失活，進而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。mTOR、4EBP1及其磷酸化蛋白的異常表達與腫瘤的發生、發展、轉移有關[19-20]，p-4EBP1的表達增加與前列腺癌患者的預后不良關系密切[21]，但相關潛在的機制仍需進一步研究。

本研究結果顯示，與C組相比，P1組中p-AMPK/?AMPK蛋白表達顯著上調，p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達顯著下調，提示丙泊酚可促進細胞AMPK磷酸化，同時抑制mTOR、4EBP1蛋白活化水平，能夠激活AMPK/mTOR/4EBP1通路。為了探討丙泊酚抑制SK-NEP-1細胞遷移和侵襲的作用機制與AMPK/mTOR/4EBP1通路是否有關，本研究使用AMPK抑制劑Compound?C抑制AMPK磷酸化。Transwell實驗結果顯示，P1組穿過細胞數和遷移細胞數顯著少于C組（P<0.05）；C組、I組、P2組的穿過細胞數和遷移細胞數比較，差異均無統計學意義，提示P2組經Compound?C和丙泊酚共同處理后，基本上逆轉了丙泊酚對SK-NEP-1細胞遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，丙泊酚可以抑制腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞遷移和侵襲，其機制可能與激活AMPK/mTOR/?4EBP1信號通路有關。但本研究存在一些局限性，首先，本研究只在單個腎母細胞瘤細胞系中進行了研究，若同時使用其他細胞株將更好地驗證丙泊酚對腎母細胞瘤的影響。其次，本研究沒有建立腫瘤模型來進一步研究丙泊酚是否影響體內腎母細胞瘤細胞的轉移，未來均需進一步進行相關研究。

[參考文獻][1] CAO?J，?SUN?L，?AN?J，?et?al.?MicroRNA-200c-3p?inhibits?proliferation?of?nephroblastoma?cells?by?targeting?CCNE2[J].?Nan?Fang?Yi?Ke?Da?Xue?Xue?Bao，?2020，?40（9）：?1246–1252.

[2] SHI?Q，?TANG?B，?LI?Y，?et?al.?Identification?of?CDC20?as?a?novel?biomarker?in?diagnosis?and?treatment?of?wilms?tumor[J].?Front?Pediatr，?2021，?9：?663054–663064.

[12] YE?L?L，?CHENG?Z?G，?CHENG?X?E，?et?al.?Propofol?regulates?miR-1-3p/IGF1?axis?to?inhibit?the?proliferation?and?accelerates?apoptosis?of?colorectal?cancer?cells[J].?Toxicol?Res，?2021，?10（4）：?696–705.