EGFR基因突變與肺腺癌腦轉移相關性研究

周 靜,胡冰琪,黃俊峰,劉 宇,王南楠,陳禮文

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,介導對細胞增殖、分化和生長至關重要的信號,其突變激活與肺腺癌的發生和進展有關[1-2]。中國肺腺癌患者中,EGFR突變率高達45%～55%。常見的EGFR突變有EGFR19缺失(19 Del)及21點突變(21 L858R),這兩種突變在所有EGFR突變中約占50%和40%[3]。目前中國臨床腫瘤協會推薦EGFR突變的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)作為一線治療藥物。但肺腺癌EGFR基因突變及其靶向藥物治療與腦轉移的相關性尚不明確。該研究通過分析初診以及EGFR-TKIs靶向治療后EGFR基因突變肺腺癌患者腦轉移比例,結合體外EGFR-TKIs敏感性實驗對相關差異進行機制探討。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性收集2018年1月—2022年3月在安徽醫科大學第二附屬醫院就診的肺腺癌患者病例資料。納入標準:① 經病理學確診為肺腺癌;② 所有患者均進行基因檢測;③ 所有患者均通過MRI、CT檢查明確是否腦轉移。剔除標準:① 其他部位的原發腫瘤;② 臨床資料不完整。該研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗材料人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞系H3255(21 L858R)購自上海富衡細胞庫;PC9(19 Del)購自北京沃比森科技有限公司;吉非替尼(Gefitinib)(10 mg/支)(貨號SML1657)購自美國Sigma-Aldrich公司;RPMI-1640及DMEM培養基購自上海源培生物科技股份公司;胎牛血清購自南京維森特生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自北京蘭杰柯科技有限公司;青-鏈霉素混合溶液、胰酶購自上海碧云天生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1藥物配制 將Gefitinib溶于DMSO中,形成10 mmol/L的原液于-80 ℃ 冰箱保存備用,同時將原液分別稀釋為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 μmol/L。實驗中各組DMSO溶劑均濃度不超過0.1%。

1.3.2細胞培養 將細胞H3255、PC9分別用RPMI-1640及高糖DMEM完全培養基中培養,培養基內含10%胎牛血清、1%雙抗(50 U/ml青霉素和0.05 mg/ml鏈霉素)。并將細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱培養后傳代。

1.3.3CCK-8法測Gefitinib對細胞的半抑制濃度IC50取對數生長期細胞,以每孔5×103個細胞,100 μl細胞懸液接種于96孔板,每組設置3個復孔,培養24 h后,分別加入100 μl不同濃度的Gefitinib溶液,培養箱中孵育72 h后加入含有10% CCK-8的完全培養基溶液,再次放入培養箱孵育1 h后,酶標儀在波長450 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。

2 結果

2.1 患者一般臨床資料的分析該研究共納入肺腺癌患者410例,年齡24～92(63±11)歲。其中在發生腦轉移的患者中,年齡≤60歲有69例(43.4%),年齡>60歲患者84例(33.5%),二者差異有統計學意義(χ2=4.103,P=0.043);淋巴結N2～3與淋巴結N0～1的患者分別為135例(39.7%),18例(25.7%),兩者差異有統計學意義(χ2=5.511,P=0.028);而腦轉移發生率在性別、吸煙史、原發病灶大小及原發病灶T之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 410例肺腺癌患者臨床特征 [n(%)]

2.2 EGFR突變與患者腦轉移的相關性410例患者中發生EGFR突變(19 Del/21 L858R)222例,EGFR野生型188例,兩者發生腦轉移分別為85例(38.3%)和68例(36.1%),差異無統計學意義(χ2=0.195,P=0.695)。EGFR突變和野生型腺癌患者在肝、骨、胸膜、腎上腺等轉移比率之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 EGFR基因突變與肺腺癌遠處轉移相關性分析[n(%)]

2.3 EGFR突變亞型與肺腺癌腦轉移的相關性104例EGFR 19 Del患者中,發生腦轉移31例(29.8%);118例EGFR 21 L858R患者中,發生腦轉移54例(45.8%),兩者差異有統計學意義(χ2=5.965,P=0.015)。EGFR 19 Del和21 L858R患者發生肝、骨、胸膜、腎上腺等部位轉移比例差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。將年齡、EGFR突變亞型、淋巴結等腦轉移影響因素進行多因素分析顯示,EGFR 21 L858R(OR=2.393;CI=1.335～4.291;P=0.003),年齡≤60歲(OR=1.884;CI=1.054～3.376;P=0.033)及淋巴結轉移N2～3(OR=3.429;CI=1.444～8.143;P=0.005)是肺腺癌腦轉移的危險因素(圖1)。

圖1 影響肺腺癌腦轉移發生的Logistic回歸分析

表3 EGFR突變亞型與肺腺癌常見遠處轉移相關性 [n(%)]

2.4 EGFR基因與腦轉移病灶相關性EGFR突變型和野生型肺腺癌患者中,多發性腦轉移灶(>3個)患者分別為45例(53%)和17例(25%)(χ2=12.237,P<0.001)。EGFR突變亞型中,19 Del和21 L858R患者腦轉移病灶呈多發灶(>3個)分別有11例(34.4%)和34例(64.2%),兩者差異有統計學意義(χ2=7.101,P=0.008),提示EGFR突變型尤其是EGFR 21 L858R更傾向于多發病灶性轉移。見表4。

表4 EGFR基因突變與腦轉移病灶相關性分析[n(%)]

2.5 EGFR基因型與初診腦轉移相關性分析在初診腦轉移患者中,EGFR野生型與突變型發病比例分別為18.6%(35/188)和21.6%(48/222),差異無統計學意義(χ2=0.569,P=0.451)。EGFR突變亞型中,19 Del和21 L858R的患者腦轉移比例分別為13.5%(14/104)和28.8%(34/118),差異有統計學意義(χ2=7.688,P=0.006)。見表5。

表5 EGFR基因型與初診腦轉移相關性分析[n(%)]

2.6 EGFR-TKIs靶向治療后腦轉移時間分析EGFR突變的患者接受EGFR-TKIs靶向治療后,分別有17例19 Del和20例21 L858R患者進展為腦轉移,其腦轉移中位數時間(月)分別為15(8.50, 25.00)和7(4.25, 12.25),兩者差異有統計學意義(P=0.013),提示21 L858R患者接受EGFR-TKIs靶向治療后腦轉移時間顯著短于19 Del患者(圖2)。

圖2 EGFR基因突變患者靶向治療后腦轉移時間

2.7 Gefitinib抑制肺腺癌PC9、H3255細胞的增殖為探討EGFR-TKIs靶向治療后21 L858R更易發生腦轉移的相關機制,該研究采用梯度濃度的Gefitinib處理肺腺癌H3255(21 L858R)和PC9(19 Del)細胞72 h,CCK-8法檢測細胞存活率并計算IC50值。相比Gefitinib未處理組細胞,Gefitinib以濃度依賴方式抑制H3255和PC9細胞增殖。計算H3255和PC9細胞的IC50分別為(0.150±0.040)和(0.037±0.008) μmol/L(P=0.007),提示攜帶19 Del的PC9細胞比H3255(21 L858R)細胞對Gefitinib更敏感。見圖3。

圖3 不同濃度Gefitinib處理2種肺腺癌細胞的生存能力及IC50

3 討論

該研究對410例肺腺癌患者的分析表明,年齡≤60歲和淋巴結N2～3分期是腦轉移高危因素。這與Ji et al[4]及吳炳群 等[5]研究結果一致,Ji et al[4]研究表明年齡≤60歲、非鱗狀細胞癌患者更易發生腦轉移;吳炳群 等[5]研究也表明年齡≤60歲和N分期越晚的NSCLC患者更易發生遠處轉移。因此,該研究揭示了肺腺癌腦轉移患者的臨床特征,同時提示在臨床工作中需重點關注符合此特征的患者,提前預防治療。該研究表明初診的EGFR 21 L858R患者較19 Del更易發生腦轉移,但EGFR野生型及突變型患者腦轉移比例無顯著差異,提示21 L858R也是肺腺癌腦轉移的一個危險因素。Enomoto et al[6]研究也表明EGFR野生型與突變型肺腺癌患者腦轉移發生率無顯著差異,但Wang et al[7]研究表明EGFR突變的晚期非鱗狀細胞肺癌患者腦轉移累積發病率顯著高于非突變患者,提示在突變類型的患者中需重點關注21 L858R患者。同時在臨床工作中可以依據該研究的3個獨立危險因素,對患者腦轉移風險進行評估及預測。該研究表明,在EGFR野生型與突變型之間以及21 L858R與19 Del之間其他遠端轉移包括骨、肝、腎上腺和胸膜轉移無顯著差異。而Doebele et al[8]表明EGFR突變的NSCLC患者傾向肝轉移,不傾向骨、腎上腺、腦等遠處轉移。上述研究結果與該研究不一致的原因可能是由于病例資料選擇的不同所致,該研究僅納入肺腺癌中晚期患者,而該研究納入標準是所有非小細胞肺癌患者。

該研究對EGFR突變亞型與腦轉移發生率關系進行分析顯示,在222例EGFR突變的患者中21 L858R的患者比19 Del更易發生腦轉移,但是對于其他遠處病灶的轉移無明顯差異性。唐珊珊 等[9]研究表明21 L858R患者較19 Del更易發生腦轉移,研究結果與該研究基本一致。為探討此種差異形成的原因,該研究采用梯度濃度的Gefitinib處理肺腺癌H3255(21 L858R)和PC9(19 Del)細胞72 h,研究表明PC9細胞對Gefitinib的IC50顯著低于H3255細胞,提示PC9細胞對Gefitinib的敏感性高于H3255細胞。該研究推測治療后21 L858R的患者容易出現腦轉移的原因可能是不同突變對靶向藥物治療的藥物療效不同所致。該研究通過臨床數據及細胞實驗提示在臨床工作中應該個體化治療,精準的打擊癌癥,從而實現最佳醫學治療效果,使患者生存期得到最大延長。目前已有研究[10-11]表明2個突變亞型對EGFR-TKIs治療敏感性不一致,19 Del對EGFR-TKIs敏感性更好,有更長的無進展生存時間、總生存期和良好的治療反應。另外,該研究考慮EGFR-TKIs治療后腦轉移發病率可能受回顧性研究時間橫斷面的影響,導致患者觀察時間不一致,造成一定的誤差,因此,該研究暫未比較治療后腦轉移發病率。

該研究表明,肺腺癌EGFR突變患者多發性腦轉移灶(>3個)發生率顯著高于野生型患者;在EGFR突變亞型中,21 L858R較19 Del患者更易出現多發(>3個)腦轉移病灶,提示EGFR突變尤其是EGFR 21 L858R傾向于多發病灶性腦轉移。研究結果與Enomoto et al[6]和Shin et al[12]基本一致,但前者觀察21 L858R與19 Del腦轉移灶的中位數分別為9.5(5～14)和12(1～12)(括號內為病灶數目范圍),差異無統計學意義。可以看出21 L858R和19 Del患者的最少轉移灶分別為5和1個,而該研究以3個為界限值,這可能是導致研究結果差異的原因。該研究表明肺腺癌EGFR突變與腦轉移病灶數目的相關性。

綜上所述,年齡≤60歲、淋巴結N2～3分期以及EGFR 21 L858R突變是肺腺癌患者發生腦轉移的高危因素。21 L858R突變患者接受EGFR-TKIs靶向治療后進展為腦轉移的中位時間顯著短于19 Del,可能與二者對靶向藥物的敏感性有關。該研究為肺腺癌患者腦轉移的風險預測及個體化靶向治療提供臨床依據。