舌鱗狀細(xì)胞癌中DKK1的表達(dá)及分子機(jī)制

孫 玥,王宏浩,李聽雨,楊敏根,黃漢瀟,后 軍

頭頸部腫瘤占常見惡性腫瘤的第6位,其中大多數(shù)為口腔鱗狀細(xì)胞癌[1]。舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)起源于舌復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞,約占口腔鱗狀細(xì)胞癌的1/3 ～ 1/2,具有惡性程度高、早期易轉(zhuǎn)移和預(yù)后差等特點(diǎn)。目前臨床治療主要以手術(shù)切除為主,以放療和化療為輔[2],然而由于舌周圍的淋巴管和血管豐富,TSCC生長速度快、早期易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且缺乏有效的分子標(biāo)志物,患者的5年生存率僅33% ～ 40%[3]。因此,探尋新的分子標(biāo)志物對TSCC患者的早期診斷和治療具有重要意義。Dickkopf相關(guān)蛋白1(DKK1)是一種Wnt/β-cateinin信號通路的抑制分子[4],其在多種腫瘤中表達(dá)異常,并在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于DKK1在腫瘤如結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]等方面的功能研究已有報(bào)道,但DKK1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的作用還不清楚。因此,該研究通過分析DKK1在TSCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平以及可能的分子機(jī)制,為DKK1靶向治療TSCC提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中下載TSCC患者轉(zhuǎn)錄組核糖核酸測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后信息[7]。收集到162例TSCC患者數(shù)據(jù),包含147例TSCC組織(15例原發(fā)腫瘤,132例病理類型不明)和15例癌旁組織。UALCAN數(shù)據(jù)庫分析520例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織和44例正常組織中DKK1的mRNA表達(dá)狀況。

1.3 差異表達(dá)基因的生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier分析方法篩選上述差異表達(dá)基因中與TSCC患者生存率相關(guān)的基因,篩選的條件是P<0.05。采用Lasson回歸法篩選TSCC患者中表達(dá)量與生存率呈負(fù)相關(guān)的代表性基因。應(yīng)用Ualcan TCGA analysis網(wǎng)址(https://ualcan.path.uab.edu/)分析與TSCC患者生存相關(guān)的差異表達(dá)基因在TSCC組織與正常口腔組織中的表達(dá)狀況。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析包括細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MP)、生物過程 (biological process,BP),而KEGG數(shù)據(jù)庫用于分析差異表達(dá)基因的信號通路。通過可視化數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(the database for annotationvisualization and integrated discovery, DAVID)對1.2中篩選出的基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析(https://david. ncifcrf.gov/)[9]。

1.5 病例資料收集2020年12月—2022年2月經(jīng)手術(shù)切除的TSCC組織50例標(biāo)本,樣本均經(jīng)病理檢查確診。其中,男性30例,女性20例;年齡<60歲者23例,年齡≥60歲者27例;腫瘤直徑<3.0 cm者39例,腫瘤直徑≥3.0 cm者11例;分化程度:高分化20例,中分化26例,低分化4例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例。

1.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

1.6.1采用免疫組化SP法檢測DKK1抗體在TSCC中的表達(dá)狀況 免疫組化SP(北京中杉金橋公司,SP-9000),DKK1抗體(英國Abcam公司,1 ∶800稀釋,ab109416),石蠟組織切4 μm厚度,65 ℃烤片2 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,微波爐EDTA抗原修復(fù)液處理2 min。之后步驟按照試劑盒說明書操作,滴加一抗,4 ℃過夜,滴加二抗,DAB顯色,中性樹膠封片。選用一抗陽性染色切片作為陽性對照,以 PBS 代替一抗的染色結(jié)果作為陰性對照。

1.6.2免疫組化結(jié)果判讀 DKK1陽性染色評分標(biāo)準(zhǔn)以著色強(qiáng)度及著色細(xì)胞數(shù)綜合判斷。隨機(jī)選擇5個(gè)未出現(xiàn)重復(fù)視野的組織進(jìn)行觀察,同時(shí)計(jì)數(shù)視野內(nèi)的細(xì)胞。以半定量積分法作為判斷結(jié)果,同時(shí)采用雙盲閱片法進(jìn)行評分。按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分:無陽性著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;按細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分:陽性細(xì)胞數(shù)<25%為0分,25% ～ 50%為1分,51% ～ 75%為2分,陽性細(xì)胞數(shù)>75%為3分。將上述2項(xiàng)得分相乘作為最終評分:0分為陰性組,評分≥1分為陽性組。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)HOEC和Cal27細(xì)胞均購自American Tissue Culture Collection公司。細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞密度約70%～80%時(shí),收集細(xì)胞。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)收集上述細(xì)胞沉淀,加入高效RIPA裂解液提細(xì)胞蛋白,采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。加入DKK1(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)、p-p65(1 ∶1 000)、p65(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)低溫過夜孵育,再加入HRP標(biāo)記的的二抗(1 ∶10 000)常溫孵育1.5 h,最后用凝膠成像儀曝光。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選取生長狀態(tài)良好、細(xì)胞密度處于50%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用Mate轉(zhuǎn)染試劑,具體操作步驟參考試劑盒說明書,轉(zhuǎn)染48～72 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行下游蛋白檢測。DKK1-siRNA序列:5′-GAGGAAACCAUCACUGAAATT-3′,3′ -UUUCAGUGAUGGUUUCCUCTT-5′。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,DKK1蛋白表達(dá)與TSCC臨床病理特征的相關(guān)性分析用采用χ2檢驗(yàn)法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 TSCC患者中的差異表達(dá)基因

2.2 生存分析實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Kaplan-Meier分析方法篩選上述7 150個(gè)差異表達(dá)基因與TSCC患者生存率的關(guān)系(以P<0.05為篩選條件),共獲得1 802個(gè)基因與患者生存率相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示,在上述基因中,有761個(gè)基因在TSCC組織中高表達(dá),并與患者的生存率密切相關(guān)。通過采用Lasso回歸法在這716個(gè)基因中篩選關(guān)鍵基因,實(shí)驗(yàn)獲得3個(gè)在TSCC組織中表達(dá)量與生存率呈負(fù)相關(guān)的基因(表達(dá)量越高,患者生存率越低),如圖2所示。

圖2 關(guān)鍵基因的生存曲線

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG通路富集分析為更深入了解上述761個(gè)差異表達(dá)基因(在TSCC組織中高表達(dá),并與患者生存率相關(guān))的功能,實(shí)驗(yàn)利用 David網(wǎng)站對其進(jìn)行GO功能和 KEGG 通路富集分析。如圖3A所示,BP結(jié)果顯示差異基因主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞器裂變、細(xì)胞核分裂和核染色體分離等生物過程;CC結(jié)果顯示,差異基因在質(zhì)膜外側(cè)面、黏著斑、細(xì)胞底物連接膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等部分成分較為豐富。同時(shí),KEGG 通路富集分析表明,差異表達(dá)基因在細(xì)胞因子與受體間相互作用、中性粒細(xì)胞聚集、膠質(zhì)瘤、細(xì)胞周期和細(xì)胞黏附分子等功能中較為活躍(圖3B)。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG功能富集分析

2.4 DKK1在TSCC及正常口腔組織中的mRNA表達(dá)通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析520例HNSC組織和44例正常組織中DKK1的mRNA表達(dá)狀況。結(jié)果顯示,與正常組織相比,HNSC組織中DKK1的mRNA表達(dá)水平增加(P<0.001,圖4A)。進(jìn)一步分析DKK1的mRNA表達(dá)與HNSC臨床病理特征的相關(guān)性,結(jié)果顯示其與HNSC臨床分期、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.001,圖4B-D)。與正常組織組相比,DKK1的mRNA在不同臨床分期(P<0.001,圖4B)、組織學(xué)分級(P<0.001,圖4C)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(P<0.001,圖4D)HNSC組織中的表達(dá)水平均增強(qiáng)。

圖4 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析DKK1 mRNA在HNSC中的表達(dá)水平

2.5 DKK1在TSCC及癌旁組織中的蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,DKK1蛋白主要定位于胞質(zhì),其在癌旁組織中呈陰性或低表達(dá),在TSCC組織中呈高表達(dá)(圖5)。在50例TSCC組織中,DKK1蛋白的陽性率(84%,42/50)高于癌旁正常口腔組織(18%,9/50)(P<0.001)。見表1。

表1 正常舌組織和TSCC組織中DKK1蛋白的表達(dá)[n(%),n=50]

圖5 TSCC組織中DKK1 蛋白的表達(dá) ×100

2.6 DKK1與TSCC臨床病理特征的關(guān)系通過分析DKK1表達(dá)與TSCC臨床病理特征的相關(guān)性研究表明,DKK1表達(dá)與TSCC臨床分期相關(guān)(P<0.05),而與TSCC患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)(表2),與UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果相一致。其中DKK1蛋白在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期TSCC組織中的陽性率(92.5%,37/40)高于Ⅰ+Ⅱ期TSCC組織(50%,5/10)(P<0.05)(表2)。上述結(jié)果提示DKK1蛋白可能參與TSCC的惡性演進(jìn)。

表2 DKK1蛋白表達(dá)與舌癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.7 敲低DKK1對β-catenin、p-p65和p65表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,與正常人口腔上皮細(xì)胞HOEC相比,DKK1在TSCC細(xì)胞Cal27中的蛋白表達(dá)水平升高。為探索DKK1在TSCC腫瘤中潛在的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)利用siRNA敲低TSCC細(xì)胞中的DKK1的表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,DKK1敲低組Cal27細(xì)胞中β-catenin、p-p65和p65蛋白表達(dá)水平下降。見圖6。

圖6 DKK1在TSCC細(xì)胞中的表達(dá)及其下游靶點(diǎn)

3 討論

DKK1基因全稱是“dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1”,其編碼的DKK1蛋白是具有2個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白,屬于Dickkopf家族[10]。DKK1蛋白通過與LRP6共受體結(jié)合,抑制Wnt/β-catenin信號通路并參與胚胎發(fā)育、骨骼形成和多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[11]。由于腫瘤微環(huán)境的不同和癌癥復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,DKK1蛋白對不同腫瘤中的不同發(fā)展階段具有不同的影響[12]。目前,DKK1作為一個(gè)腫瘤相關(guān)性抗原,能激發(fā)特異性的CD4+輔助T細(xì)胞、CD8+CTL的細(xì)胞免疫應(yīng)答以及靶向DKK1的體液免疫應(yīng)答。此外,DKN-01是一種抑制DKK1蛋白的人源化單克隆抗體,與免疫治療藥物替雷利珠單抗和化療聯(lián)合使用,治療多發(fā)性骨髓瘤、胃癌和胃食管交界癌患者[13]。DKK1蛋白與甲胎蛋白的聯(lián)合應(yīng)用,可將肝細(xì)胞癌的總體診斷率提高到87.5%[14]。DKK1在多種腫瘤組織中高表達(dá),可通過下調(diào)NK細(xì)胞功能和促進(jìn)骨髓瘤源性抑制細(xì)胞MDSCs在癌組織中的聚集來抑制抗腫瘤免疫反應(yīng),促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[15]。

該研究采用生物信息學(xué)方法,通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選到162例TSCC患者,通過癌組織和癌旁組織的NetworkAnalysed分析,共獲得7 150個(gè)差異基因。通過Kaplan-Meier分析和Lasson回歸法,實(shí)驗(yàn)篩選到3個(gè)表達(dá)量與生存率呈負(fù)相關(guān)的關(guān)鍵基因DKK1、CYP19A1和IRX4。其中,UALCAN數(shù)據(jù)庫和免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示DKK1的mRNA和蛋白水平在TSCC組織中呈高表達(dá),并且該蛋白與TSCC患者的臨床分期相關(guān),這提示DKK1可能促進(jìn)TSCC腫瘤的發(fā)生和惡性演變等生物過程。此外,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示DKK1蛋白在TSCC細(xì)胞Cal27中的表達(dá)高于正常口腔上皮細(xì)胞HOEC。 在TSCC細(xì)胞Cal27中敲低DKK1的表達(dá)后,β-catenin、p-p65和p65的表達(dá)水平也發(fā)生相應(yīng)下降,這提示DKK1可能通過下調(diào)β-catenin、p-p65和p65表達(dá)來調(diào)控TSCC腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)展過程。