四物湯對糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

朱夢姚 ，袁海陽 ，王祎 ，郭自賀 ，貢岳松，

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.江蘇鵬鷂藥業(yè)新藥創(chuàng)新中心，江蘇 宜興 214205

糖尿病主要特征為高血糖，認(rèn)知功能障礙是其常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥之一，常見記憶力減退、認(rèn)知功能障礙等癥狀，因此被認(rèn)為是阿爾茨海默病（AD）的危險因素之一[1]。高血糖能改變成年大鼠海馬區(qū)的能量代謝，改變幼鼠海馬區(qū)乳酸動態(tài)平衡和谷氨酸/谷氨酰胺循環(huán)，使樹突結(jié)構(gòu)異常，從而引起長期認(rèn)知缺陷[2]。

四物湯是補(bǔ)血養(yǎng)血的經(jīng)典方劑，最早見于《仙授理傷續(xù)斷秘方》。該方由熟地黃、當(dāng)歸、白芍和川芎組成，具有補(bǔ)血而不滯血、行血而不傷血的特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血是神志活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶的重要載體。血脈充盈、血行有度是學(xué)習(xí)記憶的生理基礎(chǔ)；血虛、血瘀導(dǎo)致的血不養(yǎng)神是學(xué)習(xí)記憶損傷的基本病機(jī)[3]。臨床研究顯示，四物湯結(jié)合中醫(yī)辨證治療老年糖尿病具有良好療效[4]。藥理研究表明，四物湯能改善缺鐵性貧血幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力[5]，提高血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[6]。此外，四物湯及組方中藥的有效成分具有雌激素樣、抗氧化、抗凋亡和改善腦損傷等多種藥理作用[7]。但關(guān)于四物湯對糖代謝異常引起的學(xué)習(xí)記憶損傷是否有改善作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）建立糖尿病小鼠模型，觀察四物湯對糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討其改善學(xué)習(xí)記憶損傷的機(jī)制，為治療糖尿病認(rèn)知功能障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級雄性ICR小鼠55只，28～34日齡，浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（浙）2019-0001。飼養(yǎng)于溫度20～22 ℃、相對濕度50%～55%環(huán)境，自由攝食飲水，晝夜交替12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批（202206A071）。

1.2 藥物與試劑

熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎飲片，南京同仁堂有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。STZ（貨號V900890），美國Sigma公司；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）ELISA試劑盒（貨號ZC-38512），上海茁彩；PBS（貨號G4202）、HE染色液（貨號G1005）、尼氏染液（貨號G1036），武漢賽維爾生物；PMSF（貨號ST506）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0010），上海碧云天；脫脂奶粉（貨號1172GR500），德國BioFroxx；RIPA裂解液（貨號FD009）、蛋白酶磷酸酶抑制劑（貨號FD1002）、GAPDH 抗體（貨號FD0063），杭州弗德生物；PSD95抗體（貨號3409S）、NR1抗體（貨號5704S），美國CST公司；Shank3抗體（貨號sc-377470），美國Santa Cruz公司；NR2B抗體（貨號21920-1-AP），美國Proteintech；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號BL003A）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（貨號BL001A），安徽Biosharp。

1.3 儀器

GA-3型血糖儀及配套血糖試紙（三諾生物傳感股份有限公司），Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀（美國TECAN公司），Ⅸ73型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司），Microfuge 20R 型微量冷凍高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司），Bisafer900-92超聲波細(xì)胞粉碎儀（美國賽飛公司），EPS300 電泳儀、5200 Multi凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備

熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎按15∶10∶10∶6比例混合，共150 g，加水浸泡30 min，用5 倍量水煎煮2 次，第1 次武火20 min、文火40 min，第2 次武火20 min，文火20 min，合并2次煎液，離心，收集上清液，濃縮至約300 mL，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組13只及模型組、四物湯低劑量組和四物湯高劑量組各14只。稱取一定量STZ粉末置于EP管中，用預(yù)冷的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）溶解，避光配制STZ溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。除空白對照組外，其余各組采用單次尾靜脈注射STZ 180 mg/kg造模。觀察小鼠食量、尿量及飲水情況，造模后3、5 d檢測小鼠空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L且出現(xiàn)多食、多飲、多尿小鼠為糖尿病小鼠[8]。小鼠成模率97.6%（41/42），每組隨機(jī)選取12只，于造模成功后開始給藥，按《太平惠民和劑局方》記載用量（每劑9 g）的2、4倍等效劑量，四物湯低、高劑量組分別予2.5、5 g/kg四物湯藥液灌胃，灌胃體積10 mL/kg，空白對照組和模型組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)40 d。給藥結(jié)束后，模型組1只小鼠死亡、1只狀態(tài)較差，因此最終每組統(tǒng)一保留10只小鼠。

2.3 體質(zhì)量、血糖和糖耐量檢測

分別于給藥第7、21、35、40日檢測小鼠體質(zhì)量和血糖水平，給藥第40日進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)。各組小鼠禁食6 h后，灌胃葡萄糖2 g/kg，體積0.1 mL/kg，尾尖采血檢測并記錄灌胃葡萄糖0、0.5、1、2 h的血糖，計(jì)算曲線下面積（AUC）。AUC=（0 h血糖+0.5 h血糖）×0.5÷2+（0.5 h血糖+1 h血糖）×0.5÷2+（1 h血糖+2 h血糖）÷2。

2.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)共5 d，前4 d為訓(xùn)練期，第5日為實(shí)驗(yàn)期。前4 d每只小鼠從4個象限各學(xué)習(xí)1次，每次1 min，1 min內(nèi)小鼠若找到水下平臺則進(jìn)行下一只，若未找到平臺，則引導(dǎo)小鼠找到平臺，并停留10 s。第5日，將小鼠隨機(jī)從某一象限放入水中，記錄小鼠1 min內(nèi)找到平臺所需的時間，即為逃避潛伏期。

2.5 取材

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，預(yù)冷PBS進(jìn)行心臟灌注，至小鼠臟器膨大、顏色變淺，冰上快速分離海馬組織，一部分放入凍存管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存，另一部分放入4%多聚甲醛固定液固定，4 ℃冰箱保存。

2.6 海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量檢測

取海馬組織，稱重后將組織剪碎，按1∶9（W/V）加入PBS，超聲細(xì)胞粉碎儀破碎1 min（360 W，工作2 s、間歇3 s），勻漿液4 ℃、5 000×g離心10 min，收集上清液。按ELISA試劑盒說明書步驟檢測海馬組織BDNF含量。

2.7 海馬神經(jīng)元病理染色

海馬組織固定24 h以上，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，按照以下步驟進(jìn)行HE染色和尼氏染色。HE染色：脫蠟、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、透明、分化；尼氏染色：脫蠟、尼氏染色、分化、終止分化、烤干、封片。染色結(jié)束后，將載玻片置于倒置顯微鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)，并拍照記錄。

2.8 Western blot檢測突觸相關(guān)蛋白表達(dá)

取海馬組織置于EP管中，將組織剪碎，加入RIPA裂解液100 μL（含1 mmol/L PMSF），按1∶100加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混勻，超聲細(xì)胞粉碎儀破碎1 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。制膠，上樣（25 μg），電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加 入 一 抗（GAPDH 1∶8 000、PSD95 1∶4 000、Shank3 1∶1 000、NR1 1∶2 000、NR2B 1∶3 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗，孵育1 h，曝光，顯影。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 四物湯對模型小鼠體質(zhì)量、血糖和糖耐量的影響

給藥前及給藥過程中，模型組和四物湯低、高劑量組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥第21日和35日，與空白對照組比較，模型組小鼠血糖明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，四物湯高劑量組小鼠血糖明顯下降（P＜0.001）。隨著給藥時間延長，四物湯低劑量組小鼠血糖有下降趨勢，給藥第35日和40日明顯降低（P＜0.001，P＜0.05）。與空白對照組比較，模型組小鼠血糖AUC明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，四物湯低劑量組小鼠血糖AUC明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖和血糖AUC比較（±s，每組10只）

4.2 四物湯對模型小鼠逃避潛伏期的影響

Morris水迷宮結(jié)果顯示，與空白對照組比較，第3日開始模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05）；與模型組比較，第4日開始四物湯低、高劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（±s，每組10只）

4.3 四物湯對模型小鼠海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠海馬組織BDNF含量有降低趨勢，但差異無計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，四物湯低、高劑量組BDNF含量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬組織BDNF含量比較（±s，每組5只）

4.4 四物湯對模型小鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)的影響

空白對照組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核淡染，細(xì)胞飽滿、排列緊密，尼氏體大且數(shù)量多，染色清晰；模型組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)明顯核固縮，細(xì)胞核深染，細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞間隙增大，區(qū)域間界限模糊，尼氏體小且數(shù)量少，染色模糊；四物湯低、高劑量組小鼠海馬CA1區(qū)可見細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核著色淺，尼氏體數(shù)量顯著增多。見圖4。

圖4 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（×200）

4.5 四物湯對模型小鼠海馬組織突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠海馬組織突觸相關(guān)蛋白PSD95、Shank3、NR1和NR2B表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。與模型組比較，四物湯低劑量組NR1和NR2B蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），四物湯高劑量組Shank3、NR1和NR2B蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），PSD95蛋白表達(dá)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、表1。

表1 各組小鼠海馬組織PSD95、Shank3、NR1和NR2B蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組小鼠海馬組織PSD95、Shank3、NR1和NR2B蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組四物湯低劑量組四物湯高劑量組NR2B 1.00±0.10 0.63±0.14***0.86±0.08#0.94±0.06##只數(shù)4 4 4 4 PSD95 1.01±0.12 0.75±0.06**0.89±0.10 0.85±0.11 Shank3 0.92±0.07 0.54±0.07***0.71±0.12 0.75±0.14#NR1 1.06±0.06 0.46±0.18***0.98±0.25##0.95±0.04##

圖5 各組小鼠海馬組織PSD95、Shank3、NR1和NR2B蛋白免疫印跡

5 討論

認(rèn)知功能障礙屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”“健忘”范疇，其病位在腦，與五臟關(guān)系密切，病機(jī)以髓減腦消、五臟氣血陰陽虛損為本，痰濁血瘀阻塞腦竅為標(biāo)[9]。人的神志活動以氣血為物質(zhì)基礎(chǔ)，血的正常運(yùn)行和充盈是心主神志的重要條件，是學(xué)習(xí)記憶的生理基礎(chǔ)[3，10]。此外，五臟正常的功能活動是維持學(xué)習(xí)記憶的重要條件，而血是連接五臟與學(xué)習(xí)記憶的內(nèi)在橋梁[3]。四物湯作為補(bǔ)血養(yǎng)血的經(jīng)典方劑，對其補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)作用的研究較多，對其神經(jīng)保護(hù)作用的研究相對較少。糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，呈氣血虧虛、陰陽失調(diào)、臟腑虛衰且夾瘀等特點(diǎn)。糖尿病患者認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險增加，因此本研究探究四物湯對糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的改善作用。

STZ被廣泛用于誘導(dǎo)糖尿病動物模型，作為一種葡萄糖類似物，STZ通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2進(jìn)入β細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)蓄積[11]。STZ通過DNA甲基化、活性氧和活性氮產(chǎn)生、氧化應(yīng)激和DNA損傷等機(jī)制導(dǎo)致β細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致高血糖和胰島素合成及釋放減少[12]。腹腔注射STZ 可使小鼠出現(xiàn)持續(xù)的高血糖、記憶缺陷[13-14]、p-tau水平升高和神經(jīng)炎癥，以及海馬區(qū)胰島素信號異常[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠體質(zhì)量下降，血糖升高，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期明顯延長，海馬組織突觸相關(guān)蛋白PSD95 和Shank3 水平明顯下降，與已有文獻(xiàn)結(jié)果[13]一致，說明模型組小鼠存在外周糖代謝異常引起的學(xué)習(xí)記憶障礙。四物湯干預(yù)可使其血糖降低，逃避潛伏期明顯縮短，Shank3蛋白表達(dá)升高，其中四物湯高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評價空間學(xué)習(xí)最常用的行為任務(wù)，廣泛用于評估嚙齒動物的學(xué)習(xí)記憶水平，該實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)過程涉及海馬和相關(guān)區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能完整性[15]。海馬結(jié)構(gòu)與神經(jīng)元可塑性、髓鞘形成和神經(jīng)元間連接相關(guān)，海馬體積與輕度認(rèn)知障礙和AD存在一定聯(lián)系[16]。海馬CA1、CA3和DG區(qū)對海馬結(jié)構(gòu)完整性和信號傳導(dǎo)具有重要作用[17-18]。HE染色使細(xì)胞核內(nèi)成分呈藍(lán)紫色，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)成分呈紅色；尼氏染色能較好地顯示尼氏體的狀態(tài)，后者可作為神經(jīng)元功能的標(biāo)志。海馬病理染色結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元核固縮，細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞間隙增大，尼氏體染色模糊，說明模型組小鼠海馬區(qū)存在神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能異常。四物湯干預(yù)可改善神經(jīng)元損傷，可見細(xì)胞核淺染，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列緊密，尼氏體染色加深。

BDNF是研究最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)可塑性的關(guān)鍵因子。成熟的BDNF（mBDNF）與高親和力酪氨酸激酶B（TrkB）受體結(jié)合，調(diào)節(jié)多種功能，如神經(jīng)元可塑性與凋亡、樹突生長和突觸可塑性等[19]。BNDF通過調(diào)節(jié)海馬突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放和增強(qiáng)突觸后神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性來調(diào)節(jié)突觸信號傳遞，進(jìn)而誘導(dǎo)突觸可塑性的長時程增強(qiáng)[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠海馬組織BDNF含量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮到STZ的生物半衰期較短，不同實(shí)驗(yàn)動物對STZ的敏感性不同，且給藥方式、劑量都會影響STZ的造模效果，可能由于本實(shí)驗(yàn)造模方法不足以引起海馬區(qū)BDNF水平顯著下降，雙側(cè)海馬注射STZ 即能引起小鼠海馬和前額葉皮層BDNF含量顯著下降[21]。此外，四物湯未能顯著提高海馬組織BDNF含量，可能原因是模型組BDNF未能顯著下降，四物湯提高BDNF水平受機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)控，BDNF滿足機(jī)體所需即可，從而使模型組與四物湯組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒于已有研究顯示，四物湯具有提高BDNF水平作用[5]，且BDNF對神經(jīng)功能有重要調(diào)節(jié)作用，因此考慮在其他學(xué)習(xí)記憶障礙相關(guān)模型中研究四物湯對BDNF及其上下游信號通路的調(diào)節(jié)。

突觸結(jié)構(gòu)是神經(jīng)元之間信息交流的基礎(chǔ)，其完整性和可塑性是神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的前提，且突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的潛在分子機(jī)制。突觸可塑性依賴于谷氨酸受體在突觸后致密區(qū)的正常整合，谷氨酸受體包括N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPAR）和代謝型谷氨酸受體（mGluR）等[22]。PSD95和Shank蛋白是突觸后致密區(qū)的重要支架蛋白，其中Shank 蛋白家族包括Shank1、Shank2和Shank3。Shank蛋白通過交聯(lián)突觸后致密區(qū)的Homer和PSD95復(fù)合物，調(diào)節(jié)mGluR和NMDAR信號通路，進(jìn)而參與和調(diào)節(jié)突觸后信號傳導(dǎo)[23-24]。突觸NMDAR信號不足會損害神經(jīng)元細(xì)胞的存活，而過度刺激谷氨酸能信號傳導(dǎo)會導(dǎo)致非興奮性毒性，使神經(jīng)細(xì)胞受損或死亡，因此NMDAR信號傳導(dǎo)必須保持在適當(dāng)水平[25]。功能性NMDAR的形成需要NR1和至少1個NR2亞基結(jié)合，其中前額葉皮層的NR2B亞基對突觸長時程增強(qiáng)和情景記憶形成至關(guān)重要[26]。在AD患者大腦額葉皮質(zhì)突觸體和突觸后致密區(qū)中，NR1 和Shank3蛋白水平顯著下降，這些蛋白的病理變化可能直接或間接影響樹突棘和突觸的功能[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，四物湯可以提高糖尿病小鼠海馬組織Shank3、NR1和NR2B 蛋白表達(dá)，但未能顯著提高PSD95 蛋白表達(dá)，說明四物湯可以恢復(fù)NMDAR信號傳導(dǎo)、上調(diào)突觸后致密區(qū)Shank3蛋白水平，恢復(fù)突觸穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

綜上，四物湯可降低尾靜脈注射STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖能力，改善海馬神經(jīng)損傷，進(jìn)而提高小鼠學(xué)習(xí)記憶水平，其機(jī)制與改善神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能異常，上調(diào)海馬組織BDNF 含量及突觸相關(guān)蛋白PSD95、Shank3、NR1和NR2B表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)元和突觸結(jié)構(gòu)方面研究四物湯對糖代謝異常引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，可為四物湯在AD相關(guān)的認(rèn)知功能障礙中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四物湯對BDNF及其上下游信號通路的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。