滋陰明目丸干預視網膜色素變性小鼠效應及機制研究

曾梅艷 ，熊萌， ，仇婧玥， ，喻昶， ，歐晨 ，宋厚盼， ，彭清華， ， ，秦裕輝，

1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208；

2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；

3.湖南中醫藥大學中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一類具有高度遺傳異質性的視網膜變性疾病。視桿細胞受損是導致RP的主要原因，患者大多表現為視力逐漸下降或視野縮窄、夜盲，通常為雙眼患病且眼底表現對稱。流行病學調查顯示，全球約有150萬RP患者，西方國家發病率為1/4 000～1/3 000，我國發病率約為1/3 500[1]。現代醫學尚缺乏有效治愈或延緩RP進展的方法。

穆勒細胞是哺乳動物視網膜最主要的神經膠質細胞，約占視網膜細胞總量的90%，因其在胚胎發育過程中與視網膜神經元有共同的干細胞來源，因此與視網膜神經細胞具有密切聯系[2]。穆勒細胞在維持視網膜正常結構和功能中發揮重要作用，其過度膠質激活可引發視網膜興奮性毒性損傷，破壞視網膜內環境離子平衡，從而加速視網膜損傷，最終形成膠質瘢痕，抑制視網膜神經再生功能，加速RP進程[3]。抑制穆勒細胞膠質化是防治RP的重要手段。

RP屬中醫學“高風雀目”“高風內障”“陰風障”范疇。臨床實踐表明，中醫藥治療RP在提高患者視力與增加視野方面具有較好療效和潛在優勢，同時對緩解患者不穩定情緒和提高生活質量具有積極意義[4]。滋陰明目丸是湖南中醫藥大學李傳課教授根據臨床經驗研制，前期研究發現，該方能提高RP患者暗適應B波振幅，降低視網膜黃斑中心凹厚度[5]。本研究探討滋陰明目丸對RP模型小鼠的干預效應及對穆勒細胞膠質化的影響，為滋陰明目丸臨床治療RP等眼底病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

4周齡SPF級C57BL/6J小鼠12只，4周齡SPF級rd10小鼠48只，雌雄各半，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，使用許可證號SYXK（湘）2018-0004，實驗動物質量合格證號1107271911002785。飼養于溫度23～25 ℃、濕度50%～55%環境，12 h/12 h明暗循環，自由攝食飲水。本研究經湖南中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會批準（LLBH-202107210001）。

1.2 藥物及制備

滋陰明目丸（熟地黃、山藥、枸杞子、黃精、三七、川芎、當歸、丹參、菟絲子、牛膝、石菖蒲等17味中藥組成），湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供，批號20211213。將藥丸置于研缽中研成粉末，以沸水溶解，攪拌均勻，制成濃度0.25 g/mL藥液。樂盯軟膠囊，廣州市范樂醫藥科技有限公司，0.5 g/粒，批號ABJ90400701。以市售花生油溶解，配制成0.008 g/mL藥液備用。復方托吡卡胺滴眼液，批號MP2228，參天制藥（中國）有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

SteadyPure 通用型RNA 提取試劑盒（批號A3A2084）、Evo M-MLV反轉錄試劑（批號A3A2044），艾科瑞生物有限公司；Pierceable Foil Heat Seal（批號1814040）、DG8 Cartridges for Droplet Generator（批號1000122527）、微滴生成油（批號64442314），美國Bio-Rad公司；蘇木素染液（批號CR2112051）、分化液（批號CR2112181）、返藍液（批號CR2112174）、伊紅染液（批號CR2202010）、 DAPI （批號CR2203098）、抗熒光淬滅封片劑（批號CR2202016）、Cy3標記山羊抗小鼠二抗（批號CR2205060），武漢賽維爾生物科技有限公司；中性樹膠（批號20211201），國藥集團化學試劑有限公司；膠質纖維酸性蛋白（GFAP）一抗（批號AI07253146），北京博奧森生物技術有限公司。

Dante包埋機，意大利DIAPATH公司；YT-12K全自動組織脫水機，湖北耀楚醫療器械科技有限公司；Galileo石蠟切片機，意大利DIAPATH公司；DMi8倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司；BA410E正置光學顯微鏡，廈門麥克奧迪醫療診斷系統有限公司；nonmyd 7非散瞳眼底照相機，日本KOWA公司；MicronⅣ造影光學相干斷層掃描一體機，美國Phoenix Research Labs公司；Ganzfeld視網膜電圖儀，美國Phoenix Research Labs公司；QX200TM數字PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 分組及給藥

將12 只C57BL/6J 小鼠作為正常對照組，48 只rd10小鼠隨機分為模型組、樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組，每組12只。樂盯組予樂盯藥液0.15 g/kg灌胃，滋陰明目丸低、高劑量組分別予滋陰明目丸藥液4.50、9.00 g/kg灌胃，正常對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續30 d。

1.5 HE染色觀察視網膜組織病理變化

給藥結束后，每組隨機取6只小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉4 mL/kg麻醉小鼠，75%乙醇消毒眼瞼周圍，摘取雙眼眼球，FAS眼球固定液固定，常規石蠟包埋，切片。依次將切片放入二甲苯、無水乙醇、75%乙醇、自來水中脫蠟至水。將切片放入蘇木素染液中染色5 min，水洗返藍，置于伊紅染液中染色5 min，無水乙醇、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖像，觀察視網膜組織病理改變。

1.6 視網膜電圖檢測視網膜功能

各組剩余6只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，置于37 ℃恒溫臺，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，采用視網膜電圖儀檢測小鼠視網膜功能。將參比電極接于兩耳間皮下，地電極接于尾部，金屬電極接于右眼角膜中央。記錄8.0×104cd/m2（持續時間1 ms）光強度刺激下的視網膜電圖反應波形，每組測6個反應波形，計算A波振幅和B波振幅。

1.7 眼底光學相干斷層掃描檢測

小鼠散瞳后以2.5%羥丙基甲基纖維素將角膜濕潤，采用MicronⅣ造影光學相干斷層掃描一體機對視網膜進行檢測。調節恒溫臺高度，使鏡頭與角膜接觸，獲取眼底圖像并對全視網膜進行掃描，分別于距視神經乳頭（ONH）150、300、450 μm處測量視網膜全層厚度。

1.8 數字PCR檢測

眼科顯微鏡下鈍性分離視網膜，使用RNA提取試劑盒提取視網膜組織總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。數字PCR 反應體系：cDNA 1 μL、Supermix 10 μL、引物1 μL、DNase-free water 8 μL。采用QX200TM數字PCR儀微滴生成器制備反應微滴。反應條件：95 ℃、10 min，94 ℃、30 s，60 ℃、45 s，68 ℃、45 s，共45 個循環；98 ℃、10 min，4 ℃、10 min。于微滴分析器中測定每個微滴FAM熒光信號，計算GFAP mRNA表達量[6]。GFAP引物序列（5'～3'）：（上游）CAACGTTAAGCTAGCCCTGGACAT，（下游）CTCACCATCCCGCATCTCCACAGT，產物長度124 bp。

1.9 免疫熒光檢測

將眼球組織石蠟切片依次放入二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水中脫蠟至水，采用EDTA抗原修復緩沖液于微波爐中對切片進行抗原修復。以免疫組化筆在視網膜組織劃圈后加入自發熒光淬滅劑，胎牛血清封閉30 min。加入GFAP一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后加入Cy3標記山羊抗小鼠二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h。滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組采集6張圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光強度[7]。

1.10 統計學方法

采用SPSS22.0 統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，先進行方差齊性檢驗，多組間比較采用方差分析，方差齊組間兩兩比較用LSD 法，方差不齊用Dunnett's T3法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 滋陰明目丸對模型小鼠視網膜病理改變的影響

正常對照組小鼠視網膜組織形態正常，內核層和外核層染色均勻，細胞形態規則、排列緊密，視錐細胞和視桿細胞層排列整齊，分界清楚；模型組小鼠視網膜明顯損傷，視錐、視桿細胞層，外核層，外叢狀層厚度顯著變薄甚至消失；滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網膜損傷明顯改善，可見明顯的視錐、視桿細胞層，外核層和外叢狀層。見圖1。

圖1 各組小鼠視網膜組織形態（HE染色，×400）

與正常對照組比較，模型組小鼠視網膜外核層厚度和外核層層數明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網膜外核層厚度和外核層層數明顯增加（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠視網膜外核層層數和厚度比較（±s）

表1 各組小鼠視網膜外核層層數和厚度比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

外核層層數12.00±0.63 3.17±0.75**6.50±1.05##6.33±1.03##7.33±0.82##組別正常對照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組只數6 6 6 6 6外核層厚度/μm 52.38±2.53 14.27±2.65**33.52±2.82##30.48±1.60##34.60±3.91##

2.2 滋陰明目丸對模型小鼠視網膜功能的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠視網膜A波振幅、B波振幅明顯減小（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網膜A波振幅、B波振幅明顯增加（P＜0.01）。見圖2、表2。

表2 各組小鼠視網膜A波振幅和B波振幅比較（±s，μV）

表2 各組小鼠視網膜A波振幅和B波振幅比較（±s，μV）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

B波振幅811.50±38.41 103.17±23.14**262.67±40.43##336.33±28.32##620.17±27.22##組別正常對照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組只數6 6 6 6 6 A波振幅911.33±30.43 56.17±12.47**294.50±29.47##405.67±21.99##573.17±29.60##

圖2 各組小鼠視網膜電圖

2.3 滋陰明目丸對模型小鼠視網膜厚度的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠視網膜在3個測量點的厚度均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸高劑量組小鼠視網膜在3個測量點的厚度均明顯增加（P＜0.01）。見圖3、表3。

表3 各組小鼠視網膜厚度比較（±s，μm）

表3 各組小鼠視網膜厚度比較（±s，μm）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別正常對照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組距ONH 450 μm 257.83± 5.91 153.67± 7.20**199.17± 8.70##162.83± 5.85 211.17±10.48##只數6 6 6 6 6距ONH 150 μm 228.17±6.11 137.17±4.79**187.67±6.25##144.17±5.78 194.17±5.98##距ONH 300 μm 246.17±7.52 146.17±7.60**193.67±7.92##150.17±7.28 206.67±6.56##

圖3 各組小鼠視網膜光學相干斷層掃描

2.4 滋陰明目丸對模型小鼠視網膜膠質纖維酸性蛋白mRNA表達的影響

GFAP是視網膜穆勒細胞膠質化的標志蛋白。與正常對照組比較，模型組小鼠視網膜GFAP mRNA平均拷貝數和總拷貝數均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網膜GFAP mRNA平均拷貝數和總拷貝數均明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠視網膜GFAP mRNA表達比較（±s）

表4 各組小鼠視網膜GFAP mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

只數總拷貝數1 356.17±33.17 2 360.33±58.59**1 604.83±55.80##1 721.83±65.10##1 428.17±57.30##組別正常對照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組6 6 6 6 6平均拷貝數67.33±3.20 118.67±9.54**80.05±1.94##86.33±3.61##71.50±3.94##

2.5 滋陰明目丸對模型小鼠視網膜膠質纖維酸性蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠視網膜GFAP蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網膜GFAP蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。見圖4、表5。

表5 各組小鼠視網膜GFAP蛋白表達比較（±s）

表5 各組小鼠視網膜GFAP蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

平均熒光強度4.87±1.06 23.26±3.41**6.32±0.82##8.61±1.21##6.20±0.94##組別正常對照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組只數6 6 6 6 6

圖4 各組小鼠視網膜GFAP蛋白表達（免疫熒光染色）

3 討論

RP是一種以視桿細胞和視錐細胞受累為主的遺傳性進行性視網膜疾病，分為綜合征型和非綜合征型兩大類：前者發病過程可累及其他器官，導致功能障礙；后者發病部位主要在眼部，約占RP病例總數的80%[8]。盡管基因治療、干細胞治療、視網膜假體等新型治療手段已應用于RP治療，但這些方法對不同患者療效差異較大，且存在價格昂貴、不良反應大等問題[9]。

先天稟賦不足、后天失養是導致RP的基本原因。先天不足多責之于腎臟虛勞，元陽匱乏。后天失養與脾胃虧虛、氣血不足、精血不能濡養目睛有關，病程日久，脈絡阻閉，神光衰微，視野縮窄、視力減退。RP核心病機為虛中夾瘀，以虛為本，絡脈瘀阻為標，補虛活血、通絡明目是RP的關鍵治法。滋陰明目丸具有補虛滋陰、活血明目功效。課題組前期拆方研究發現，方中枸杞子、丹參配伍可抑制rd10小鼠視網膜細胞凋亡，維持視網膜正常結構，從而保護視功能[10]。

rd10小鼠為RP最常用的動物模型，該品系小鼠出生后17 d視網膜全層及外核層厚度均與正常小鼠接近，此后視網膜開始變性，相較于其他RP動物模型，rd10小鼠視網膜變性開始的時間推后、變性速度減緩，能準確地模擬RP發病過程[11]。本研究HE染色結果表明，rd10小鼠視網膜出現明顯損傷，外核層顯著變薄，予滋陰明目丸治療后，視網膜組織損傷得到明顯改善，外核層層數和厚度均顯著增加。視網膜電圖是檢測視網膜功能的常用方法，視網膜電圖A波可反映視桿細胞和視錐細胞的功能，主要用于評價視網膜能否正常接收光信號；B波可反映視網膜內穆勒細胞和雙極細胞功能，主要用于評價光信號能否傳遞到大腦[12]。本研究結果顯示，模型組小鼠視網膜功能明顯減弱，表現為A波振幅和B波振幅均顯著減少。經滋陰明目丸治療后，模型小鼠A波振幅和B波振幅均顯著增加，提示滋陰明目丸能提高RP模型小鼠視網膜功能。

光學相干斷層掃描可對活體內部形態進行非侵入、無損傷、無接觸的檢測，獲取組織內部結構的橫斷面圖像，廣泛應用于各專科領域，其中眼科疾病的診療方面應用最為成功[13]。本研究采用該技術檢測滋陰明目丸對RP模型小鼠的作用效果，結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠視網膜全層厚度顯著降低。給予高劑量滋陰明目丸治療后，在距離ONH 150、300、450 μm 3個測量點，小鼠視網膜全層厚度均顯著增加。

穆勒細胞是一類廣泛存在于視網膜中的放射狀膠質細胞，與其他視網膜神經細胞具有共同的祖細胞。穆勒細胞的主要功能為支撐視網膜，為視網膜血管和神經元提供代謝支持[14]。研究表明，穆勒細胞具有視網膜前體細胞屬性，可自我更新并分化成視網膜特異的神經元，如視錐細胞和視桿細胞。因此，抑制穆勒細胞膠質化、促進其分化是治療RP 的重要途徑[15]。GFAP可特異性表達于視網膜穆勒細胞，當穆勒細胞受損時，伴隨細胞膠質化的發生，GFAP在穆勒細胞大量合成與堆積。采用數字PCR和免疫熒光法從分子水平檢測滋陰明目丸治療RP的作用機制，結果顯示，模型組小鼠視網膜GFAP mRNA 和蛋白表達均顯著上調，提示模型組小鼠視網膜穆勒細胞發生膠質化。給予滋陰明目丸治療后，小鼠視網膜GFAP mRNA和蛋白表達均顯著下調，提示滋陰明目丸能抑制穆勒細胞膠質化。

綜上所述，滋陰明目丸可修復RP小鼠視網膜組織損傷，增加視網膜外核層和視網膜全層厚度，提升視網膜A波和B波振幅，改善視網膜功能，其分子機制與下調視網膜GFAP mRNA和蛋白表達、抑制視網膜穆勒細胞膠質化有關。