基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路的黃芪-丹參配伍對缺氧/復氧誘導的H9C2細胞壞死性凋亡的影響

張丞波 ，王新東，

1.南京中醫藥大學第三臨床醫學院，江蘇 南京 210028；

2.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028

隨著急診經皮冠脈介入血運重建治療的積極開展和規范化藥物治療的認真貫徹，急性心肌梗死（AMI）的即刻死亡率明顯下降。然而開通閉塞血管恢復血流的同時可導致心肌缺血再灌注損傷，并伴有心律失常、心肌壞死和細胞凋亡。缺血再灌注損傷對心肌細胞凋亡、壞死等細胞的影響決定了心肌梗死的遠期預后。越來越多的證據表明，壞死性凋亡可加重心肌梗死和缺血再灌注損傷的發生發展[1-2]，在缺血/再灌注損傷期間的細胞死亡中起重要作用[3]。

壞死性凋亡是細胞程序性死亡的途徑之一，激活RIPK1/RIPK3/MLKL通路可誘導壞死性凋亡[4]。抑制受體相互作用蛋白（RIP）1可減小梗死面積[5]，RIP3在心肌細胞中表達并與線粒體共定位，介導心肌梗死后的炎癥、活性氧生成和不良心臟重塑[6]。因此，壞死性凋亡通路可作為改善心室功能和縮小心肌梗死面積的靶點。鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的主要機制[7]，鈣調蛋白激酶（CaMK）Ⅱ在心肌組織中表達豐富，主要亞型為CaMKⅡδ。CaMKⅡ參與多種程序性細胞死亡途徑的調節[8]，包括壞死性凋亡，并且由RIP3 介導[9]?？梢奀aMKⅡ、RIPK1/RIPK3/MLKL通路與壞死性凋亡存在串話關系。

益氣活血法是冠心病的經典治法[10-11]。補氣藥黃芪和活血藥丹參的配伍應用是益氣活血法的代表藥對，具有抗心肌缺血性重構及調控Ca2+通道等效應[12-15]。前期研究表明，黃芪-丹參配伍通過調節瞬時受體電位通道1 介導的CaMK 抑制缺血性心肌重構[12]?；贑aMKⅡδ與RIPK1/RIPK3/MLKL信號間的可能關系，本研究進一步觀察黃芪-丹參配伍對缺氧/復氧誘導的心肌細胞H9C2壞死性凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

大鼠心肌細胞H9C2，購于武漢Procell公司，貨號CL-0089。

1.2 藥物及制備

黃芪、丹參飲片購自南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院中藥房。根據2020年版《中華人民共和國藥典》最大推薦用量（黃芪30 g、丹參15 g）[16]，取黃芪6 kg、丹參3 kg，加水，回流提取1.5 h×2 次，過濾，合并濾液，減壓濃縮為稠膏，以95%乙醇調節含醇量為70%，靜置沉淀后取上清液，105 ℃減壓干燥48 h，制成黃芪丹參干粉，1 g干粉相當于5 g飲片。采用高效液相色譜法檢測黃芪丹參干粉質控成分黃芪甲苷和丹參素含量[17]。

取適量黃芪丹參干粉，加入PBS，80 ℃恒溫水浴鍋加熱使其充分溶解，12 000 r/min離心5 min×2次，上清液以0.45 μm濾膜過濾，超凈工作臺內用0.22 μm濾膜過濾藥液除菌，-20 ℃保存備用。

分別取0.1、0.5、1 mL配制好的干粉溶液，置于1.5 mL離心管中（提前稱定質量），60 ℃烘箱中放置48 h蒸干水分，再次稱量離心管質量，計算2次質量差值，即為藥物質量，根據對應體積計算藥物濃度，取平均值作為實際藥物濃度。

1.3 主要試劑與儀器

CaMKⅡδ、受體相互作用蛋白激酶（RIPK）1、RIPK3、混合系激酶區域樣蛋白（MLKL）、GAPDH抗體（英國Abcam 公司，貨號分別為ab181052、ab300617、ab255705、ab9485），心肌細胞專用培養基（武漢Procell公司，貨號CM-0089），胎牛血清（美國Gibco，貨號C0235），CaMKⅡδ 激活劑油酸（德國Sigma，貨號O1008），CaMKⅡδ抑制劑KN-93磷酸鹽（美國Selleck，貨號S7423），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（德國Sigma公司，貨號APOAF），反轉錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒（日本Takara公司，貨號分別為RR036A、RR820A），PVDF 膜（美國Millipore公司，貨號ISEQ00010），CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、Trizol、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光液（上海碧云天公司，貨號分別為C0037、C0016、R0016、P0012S、P0018FS）。

超凈工作臺（新加坡ESCO公司，型號ACB-6E1），CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號310370），多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號Varioskan LUX），流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司，型號CytoFLEX），RTPCR 循環儀（美國Bio-Rad 公司，型號CFX Opus Deepwell），電泳儀（美國Bio-Rad 公司，型號PowerPac），化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司，型號ChemiDocTMTouch）。

1.4 細胞培養及造模

H9C2細胞用心肌細胞專用培養基（含10%胎牛血清、1%雙抗），于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。將培養基替換為無血清培養基，于37 ℃、95%N2、5%CO2培養箱中缺氧培養4 h。隨后替換成含10%胎牛血清培養基，于37 ℃、5%CO2、95%空氣培養箱中復氧培養12 h制備缺氧/復氧模型。

1.5 CCK-8法檢測細胞存活率

取對數生長期細胞，胰酶消化制成細胞懸液，將細胞以1×104個/孔密度接種至96孔培養板，置于培養箱培養過夜。將細胞分為對照組、模型組和黃芪丹參組，黃芪丹參組分別加入20、40、60、80 μg/mL干粉溶液處理2 h，按“1.4”項下方法缺氧/復氧造模處理，培養結束后，每孔加入CCK-8 工作液100 μL，在37 ℃、5%CO2培養箱中繼續孵育2 h，酶標儀波長450 nm處檢測各孔吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗孔吸光度-空白孔吸光度）÷（對照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.6 分組及干預

將細胞分為對照組、模型組、黃芪丹參組、黃芪丹參+激活劑組和抑制劑組。對照組正常培養，其余各組按“1.4”項下方法制備缺氧/復氧模型。黃芪丹參組造模前2 h用60 μg/mL干粉溶液預處理細胞，黃芪丹參+激活劑組造模前2 h用100 μmol/L油酸和60 μg/mL干粉溶液預處理細胞，抑制劑組造模前2 h用10 μmol/L KN-93磷酸鹽預處理細胞。

1.7 乳酸脫氫酶水平檢測

細胞按“1.6”項下分組處理后，收集培養液，1 000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書操作，酶標儀波長450 nm測量吸光度，計算LDH釋放率。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞按“1.6”項下分組處理，預冷PBS清洗3次，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用PBS重懸，用碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC對細胞進行染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.9 RT-qPCR檢測

用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定RNA濃度。反轉錄試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR試劑盒進行擴增。反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個循環。以GAPDH 為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 Western blot檢測

加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后，取等量蛋白（30 μg）上樣，10%SDS-PAGE（100 V、120 min）分離，轉膜至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入CaMKⅡδ、RIPK、RIPK3、MLKL 一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入二抗（1∶20 000），室溫孵育 1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。使用ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.11 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間兩兩比較用方差分析，Tukey法進行多重比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪-丹參濃度篩選

CCK-8檢測結果顯示，造模處理后，與對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組對細胞存活率有促進作用（見圖1），尤其是濃度60、80 μg/mL（P＜0.01），且60 μg/mL作用優于80 μg/mL（P＜0.05），因此選用60 μg/mL作為細胞干預濃度。

圖1 各組H9C2細胞存活率比較（±s，n=6）

2.2 黃芪-丹參對H9C2 細胞上清液乳酸脫氫酶水平的影響

與對照組比較，模型組細胞上清液LDH釋放率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組和抑制劑組細胞上清液LDH釋放率明顯降低（P＜0.01）；與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細胞上清液LDH釋放率明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組H9C2細胞上清液 LDH釋放比較（±s，n=6）

2.3 黃芪-丹參對H9C2細胞凋亡的影響

與對照組比較，模型組細胞凋亡水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參+激活劑組、黃芪丹參組和抑制劑組細胞凋亡水平明顯降低（P＜0.01）。與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細胞凋亡水平明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組H9C2細胞凋亡比較（±s，n=6）

2.4 黃芪-丹參對H9C2 細胞CaMK Ⅱδ-RIPK1/RIPK3-MLKL信號通路mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組和抑制劑組細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3 和MLKL mRNA 表達明顯降低（P＜0.05）；與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組H9C2細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達比較（±s）

表2 各組H9C2細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪丹參組比較，△P＜0.05

組別對照組模型組黃芪丹參+激活劑組黃芪丹參組抑制劑組MLKL 1.09±0.12 2.96±0.56**2.52±0.29△1.62±0.26#2.07±0.86#n 3 3 3 3 3 CaMKⅡδ 1.08±0.11 3.12±0.29**3.21±0.46△1.49±0.86#1.27±0.42#RIPK1 1.06±0.25 3.84±0.41**3.64±0.58△2.22±0.63#2.02±0.11#RIPK3 1.07±0.21 3.29±0.25**2.92±0.46△1.58±0.58#1.68±0.46#

2.5 黃芪-丹參對H9C2 細胞CaMK Ⅱδ-RIPK1/RIPK3-MLKL信號通路蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組和抑制劑組細胞CaMK Ⅱδ、RIPK1、RIPK3 和MLKL 蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細胞CaMKⅡδ、RIPK3 和MLKL 蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表3。

圖4 各組H9C2細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白免疫印跡

表3 各組H9C2細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達比較（±s）

表3 各組H9C2細胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與黃芪丹參組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組模型組黃芪丹參+激活劑組黃芪丹參組抑制劑組MLKL 0.12±0.03 0.73±0.11**0.61±0.18△0.26±0.08##0.22±0.02##n 3 3 3 3 3 CaMKⅡδ 0.19±0.05 2.89±0.32**1.92±0.21#△△0.28±0.08##0.16±0.06##RIPK1 0.31±0.08 2.31±0.19**1.23±0.21##0.86±0.17##0.52±0.11##△RIPK3 0.82±0.19 2.12±0.21**1.96±0.23△0.92±0.34##0.98±0.27##

3 討論

本研究結果顯示，黃芪-丹參預處理在缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷中起保護作用，表現為提高細胞存活率，降低LDH釋放和壞死性凋亡。

壞死性凋亡是壞死細胞死亡的程序化形式，心肌細胞的壞死性凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要標志[18]。壞死性凋亡受壞死性凋亡調節蛋白（如RIPK1、RIPK3和MLKL）調控，RIP1位于細胞質中，廣泛分布于心肌組織，是壞死性凋亡的關鍵調節因子。死亡受體的激活進一步激活RIPK1，RIPK1 轉移并結合RIPK3和MLKL，形成復合物，RIP3-MLKL復合物會誘導壞死性凋亡[19]。本研究中，缺氧/復氧損傷能上調細胞RIPK1、RIPK3和MLKL表達，黃芪-丹參預處理能顯著下調缺氧/復氧誘導的RIPK1、RIPK3和MLKL表達，提示黃芪-丹參通過RIPK1-RIPK3-MLKL途徑減輕心肌細胞壞死性凋亡。

持續的CaMKⅡ激活在多種心臟疾病的發病機制中起主要作用。CaMKⅡ激活誘發程序性細胞死亡，包括細胞凋亡和壞死性凋亡，加速心力衰竭[20]。CaMKⅡ整合β-腎上腺素能、Gq偶聯受體、活性氧、高血糖和促凋亡細胞因子信號傳導，通過內在和外在途徑誘發心肌細胞凋亡[8]。此外，壞死性凋亡調節蛋白活性也與CaMKⅡ相關[21]。為闡明CaMKⅡδ與壞死性凋亡通路RIPK1/RIPK3-MLKL 的關系，本研究進一步檢測CaMKⅡ抑制劑KN-93磷酸鹽和激動劑油酸干預對缺氧/復氧誘導的心肌細胞RIPK1、RIPK3、MLKL表達的影響。結果顯示，CaMKⅡ抑制劑預處理顯著下調缺氧/復氧誘導的H9C2細胞RIPK1、RIPK3和MLKL表達，結合抑制劑組細胞凋亡率和上清液LDH水平降低，提示CaMKⅡ抑制劑通過RIPK1/RIPK3-MLKL途徑減輕心肌細胞壞死性凋亡。同時發現，CaMKⅡ激動劑可以逆轉黃芪-丹參抑制細胞凋亡的調控效應，提示黃芪-丹參對RIPK1/RIPK3-MLKL途徑介導的心肌細胞壞死性凋亡的調控作用與調控CaMKⅡ有關。結合前期研究[12]，本研究結果進一步表明，黃芪-丹參可下調缺氧/復氧誘導的CaMKⅡδ表達。

綜上，黃芪-丹參配伍對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷具有保護作用，其機制與下調CaMKⅡδ表達，抑制RIPK1/RIPK3-MLKL通路激活，從而緩解細胞凋亡性壞死有關。