淫羊藿苷通過上調 TRIB1 抑制核轉錄因子 -κB 緩解類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞炎癥

吳志明　李慧　周易芬　曹正柳　張鵬　萬欣　郭健

【摘 要】目的：探討淫羊藿苷（ICA）是否通過上調TRIB1表達抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）緩解類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞（RA-FLS）炎癥。方法：收集南昌大學第一附屬醫院接受膝關節置換手術的活動期類風濕關節炎（RA）患者的滑膜組織，分離培養RA-FLS后，用腫瘤壞死因子-α（TNF-α，10 ng·mL^-1）處理RA-FLS建立炎癥細胞模型。首先，為明確ICA抑制RA-FLS增殖和炎癥，促進細胞凋亡，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組；然后，為明確TRIB1過表達可抑制RA-FLS的增殖和炎癥，促進細胞凋亡，空白vector或oe-TRIB1轉染TNF-α處理的RA-FLS，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + vector組、TNF-α + TRIB1組；接著，為明確ICA以依賴于TRIB1的方式抑制NF-κB，siTRIB1轉染TNF-α處理的RA-FLS細胞，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組、TNF-α + ICA + siTRIB1組。分別采用qRT-PCR、Western blot檢測基因和蛋白水平；ELISA檢測炎性細胞因子；CCK-8、流式細胞術檢測細胞增殖和凋亡。結果：ICA處理和TRIB1過表達均抑制TNF-α誘導的RA-FLS的增殖和炎癥反應，且促進其凋亡。TNF-α處理后RA-FLS中p-p65和p-IκB水平顯著上調，但ICA顯著降低p-p65和p-IκB水平；且與siTRIB1聯合治療時，ICA的抑制作用消失。結論：ICA通過上調TRIB1抑制NF-κB緩解RA，提示ICA可能是一種有前景的治療RA藥物。

【關鍵詞】 類風濕關節炎；淫羊藿苷；TRIB1；核轉錄因子-κB；成纖維樣滑膜細胞

Icariin Alleviating Fibroblastic Synovial Cell Inflammation in Rheumatoid Arthritis by Upregulating TRIB1 to Inhibit NF-κB

WU Zhi-ming，LI Hui，ZHOU Yi-fen，CAO Zheng-liu，ZHANG Peng，WAN Xin，GUO Jian

【ABSTRACT】Objective：To investigate whether icariin（ICA）relieves inflammation of rheumatoid arthritis fibroblastic synovial（RA-FLS）cells by upregulating TRIB1 to inhibit nuclear transcription factors-κB（NF-κB）.Methods：The synovial tissue of patients with RA who underwent knee Joint replacement surgery in the First Affiliated Hospital of Nanchang University was collected，and RA-FLS cells were isolated and cultured.TNF-α（10 ng·mL^-1）was used to deal with RA-FLS cells to establish inflammatory cell models.Firstly，to clarify that ICA inhibits the proliferation and inflammation of RA-FLS cells and promote cell apoptosis，the blank control group，the TNF-α processing group，and the TNF-α + ICA group were established.Then，to clarify that overexpression of TRIB1 can inhibit the proliferation and inflammation of RA-FLS，and promote cell apoptosis，and blank vector or oe-TRIB1 was transfected into TNF-α processed RA-FLS cells，the Control group，the TNF-α processing group，the TNF-α + Vector group，TNF-α + TRIB1 group were established.Next，to clarify that ICA inhibits NF-κB dependent on TRIB1，and siTRIB1 transfecting TNF-α processed RA-FLS cells，the blank control group the TNF-α processing group，the TNF-α + ICA group，the TNF-α + ICA + siTRIB1 group were established.Gene and protein levels were detected using qRT-PCR?and Western blot，respectively;ELISA was used to detect inflammatory cytokines;and CCK-8 and flow cytometry were used to detect cell proliferation and apoptosis.Results：Both ICA treatment and TRIB1 overexpression inhibited TNF-α induced proliferation and inflammatory response of RA-FLS cells，and promoted their apoptosis.The levels of p-p65 and p-IκB in the TNF-α processed RA-FLS cells significantly upregulated，but ICA significantly reduced the levels of p-p65 and p-IκB.When combined with sitRIB1 in the treatment，the inhibitory effect of ICA disappears.Conclusion：ICA inhibits NF by upregulating TRIB1-κB to alleviate RA，suggesting that ICA may be a promising therapeutic drug for RA.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;icariin;TRIB1;nuclear transcription factor-κB;fibroblastic synovial cells

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種免疫性疾病，表現為對稱性關節炎，常伴有軟骨破壞、骨侵蝕［1］，是患者殘疾和生活質量下降的常見原因［2-3］。RA發病涉及各類免疫細胞和成纖維樣滑膜細胞（FLS）功能異常［4］。目前，免疫抑制劑（如甲氨蝶呤、來氟米特）和生物制劑等治療有一定的療效［5-6］，但患者面臨著巨大的經濟和身體負擔。

淫羊藿苷（ICA）是中草藥淫羊藿的重要單體，具有骨愈合及骨保護作用［7］。PU等［8］發現，ICA通過抑制FLS增殖保護骨損害緩解RA；WEI等［9］發現，ICA可抑制RA小鼠的骨降解。說明ICA可用于治療RA，但機制不明。

哺乳動物TRIB家族蛋白主要包括TRIB1、TRIB2和TRIB3，在多種生物學和病理過程中發揮關鍵作用，如糖尿病和關節炎［10］。TRIB1作為天然免疫的重要媒介，被證實在調控RA中發揮關鍵作用。OKUMA等［11］發現，TRIB1沉默導致腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和CCAAT/增強結合蛋白（C/EBP）β表達增加，促進軟骨降解。DUGAST等［12］發現，TRIB1過表達可提高FoxP3的表達控制RA。由此可見，TRIB1對RA具有巨大的調控作用，但TRIB1是否參與ICA對RA的調控尚不清楚。

研究證實，核轉錄因子-κB（NF-κB）通路可作為ICA的下游功能通路［13］，表明ICA、TRIB1和NF-κB之間可能存在聯系。本研究采用TNF-α誘導的RA-FLS探討ICA是否通過上調TRIB1抑制NF-κB改善RA。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 ICA單體藥材（南京金斯瑞生物與科技公司，批號20190801）；抗TRIB1抗體、抗p-p65抗體、抗p65抗體、抗p-IκB抗體、抗IκB抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗IL-6抗體、抗IL-8抗體、抗IL-1β抗體、抗β-actin抗體、抗Histone 3抗體（英國Abcam公司，1∶1000，批號分別為ab137717，ab76302，ab32536，ab133462，ab32518，ab32503，ab32124，ab214429，ab235584，ab216995，ab8227，ab267372）；二抗（英國Abcam公司，1∶10 000，批號ab7090）；人IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA試劑（Sigma-Aldrich，批號分別為RAB0273，RAB0306，RAB0319）；oe-TRIB1過表達質粒及其陰性對照載體（中國上海GenePharma公司）；Lipofectamine?3000（美國Invitrogen公司，批號L3000008）；CCK-8試劑［生工生物工程（上海）股份有限公司，批號E606335］；Annexin V-FITC和PI染色試劑（上海碧云天生物技術有限公司，批號C1062L）；TRIzol （Thermo Fisher Scientific公司，批號15596018）；逆轉錄酶試劑盒（日本東京Toyobo公司，批號FSQ-101）；Ultra SYBR混合試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，批號1176202K）。

1.2 臨床標本 滑膜組織取自接受膝關節置換手術的活動期RA患者，符合美國風濕病學會（ACR）修定的RA診斷標準［14］。本研究通過南昌大學第一附屬醫院倫理委員會審查，所有參與者均簽署知情同意書，倫理編號（2021）醫研倫審第（9-006）號。

1.3 主要儀器 微孔板分光光度計（型號NanoDrop 2000c，美國Thermo Fisher Scientific公司）；倒置顯微鏡（型號IX73，日本奧林巴斯公司）；凝膠成像系統（型號Gel Doc EZ，美國Bio-Rad）；轉膜儀（型號170-3940，英國 Biorad 公司）。

2 方 法

2.1 RA-FLS分離、培養及處理 將收集的RA滑膜組織切成小塊，與膠原酶Ⅰ在37 ℃下孵育3 h，分離RA-FLS。細胞培養于含體積分數為10%的胎牛血清和體積分數為1%的青霉素/鏈霉素溶液DMEM培養基，培養條件為體積分數為5%的CO₂、37 ℃。培養結束后用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，直到融合度達到95%，收集細胞，重新懸浮，種植增殖。選取第3～6代RA-FLS進行后續實驗。建立炎癥細胞模型，用TNF-α（10 ng·mL^-1）預處理RA-FLS 24 h，然后用不同摩爾濃度（10，20，40，80 μmmol·L^-1）的ICA再處理炎癥細胞24 h。

2.2 ICA單體藥液的配制 參照ICA配制說明書調配母液即儲存液。按說明書中ICA單體/DMSO溶劑：10 mg/14.778 5 mL比例進行調配。首先，取50 mL離心管，在管內放入稱取的10 mg ICA單體粉末，然后加入14.778 5 mL的DMSO溶劑，充分溶解混勻，即配成10 mmol·L^-1的母液，常溫保存。使用時根據所需濃度按照一定比例進行稀釋，即得到所需濃度的藥液。

2.3 實驗分組 首先，為明確ICA抑制RA-FLS細胞增殖和炎癥，促進細胞凋亡，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組；然后，為明確TRIB1過表達可抑制RA-FLS的增殖和炎癥，促進細胞凋亡，空白vector或oe-TRIB1轉染TNF-α處理的RA-FLS細胞，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + vector組、TNF-α + TRIB1組；接著，為明確ICA以依賴于TRIB1的方式抑制NF-κB，siTRIB1轉染TNF-α處理的RA-FLS細胞，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組、TNF-α + ICA + siTRIB1組。

2.4 實驗檢測指標及方法

2.4.1 細胞轉染 siTRIB1、oe-TRIB1以及它們的陰性對照（空白vector）從GenePharma獲得。體外轉染時，使用Lipofectamine? 3000將載體和質粒轉染細胞。驗證TRIB1過表達可抑制RA-FLS的增殖和炎癥時，TNF-α + vector組中TNF-α處理的RA-FLS用空白vector進行轉染；TNF-α +?TRIB1組中TNF-α處理的RA-FLS用oe-TRIB1進行轉染。驗證ICA以依賴于TRIB1的方式抑制NF-κB通路激活時，TNF-α + ICA + siTRIB1組中TNF-α + ICA處理的RA-FLS用siTRIB1轉染。

2.4.2 CCK8檢測細胞活性實驗 將不同處理的細胞（2×10⁴）接種于96孔板中培養。然后，細胞與10 μL的CCK-8溶液孵育2 h。使用微孔板分光光度計在450 nm處檢測吸光度。

2.4.3 細胞凋亡實驗 處理后，收集細胞，PBS洗滌，用500 μL 1X Annexin-binding buffer重懸。然后用Annexin V-FITC和PI染色孵育細胞10 min。

立即用流式細胞儀分析樣品。

2.4.4 免疫印跡實驗（Western blot） 用RIPA分離蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。經12% SDS-PAGE分離后，蛋白轉移到PVDF膜上。然后膜與TRIB1、p-p65、p65、p-IκB、Bax、Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-1β、β-actin抗體和組蛋白3孵育過夜。PBS-T洗滌后，膜與相應的二抗孵育60 min。用GEL成像系統對膜進行可視化和成像。蛋白定量用Image J軟件進行分析。

2.4.5 酶聯免疫吸附實驗（ELISA） 采用人IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA試劑盒，按照相應的說明程序檢測IL-1β、IL-6和IL-8水平。最后的數據在microboard reader中測量。

2.4.6 qRT-PCR實驗 使用TRIzol提取總RNA，逆轉錄酶試劑盒合成cDNA。然后，使用Ultra SYBR mix試劑盒對cDNA進行qRT-PCR檢測。mRNA的相對表達量用GAPDH歸一化，2?ΔΔCT法計算。引物序列見表1。

2.5 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以表示；方差分析前采用Shapiro-Wilk檢驗對數據進行正態性評估，方差齊性分析采用Bartlett檢驗；兩兩比較采用Student's t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 RA-FLS的培養鑒定及活性檢測 采用膠原酶消化培養法分離人RA-FLS，6 h左右貼壁細胞比率達60%，20 d左右細胞融合度可達70%，約４周融合度達95%，細胞形態見RA-FLS貼壁聚集生長，呈長梭形或紡錘形，類神經元細胞，胞核位于細胞中央，見圖1。Vimentin是在RA-FLS中特異表達的微絲蛋白［15］，采用細胞免疫熒光實驗顯示細胞表達綠色Vimentin微絲蛋白，證明本研究分離培養的細胞為RA-FLS，且Vimentin細胞陽性率 > 95%，獲得均一性良好的RA-FLS，見圖1（2）。

3.2 ICA對RA-FLS增殖和炎癥作用及對細胞凋亡的促進作用 TNF-α能顯著促進RA-FLS增殖，ICA預處理能顯著抑制TNF-α誘導的RA-FLS增殖，且呈濃度依賴性，見表2。凋亡檢測表明，TNF-α刺激后RA-FLS凋亡顯著減少，而ICA處理后細胞凋亡明顯增加。ELISA表明，TNF-α處理導致RA-FLS中促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8顯著增加，但ICA處理顯著降低上述炎性細胞因子，見表3。ICA治療后，TNF-α處理引起的Bcl-2、IL-1β、IL-6和IL-8蛋白水平升高受到抑制，Bax蛋白水平反而升高，見表4。

3.3 TRIB1過表達對RA-FLS細胞增殖和炎癥的抑制作用及對RA-FLS凋亡的誘導作用 TRIB1對RA的疾病活動及進展具有較大的調控作用。為了進一步明確TRIB1在RA中的作用，將空白vector或oe-TRIB1轉染到RA-FLS中。在oe-TRIB1轉染的TNF-α處理的RA-FLS中TRIB1水平顯著升高，p-p65和p-IκB水平顯著抑制，見表5；過表達的TRIB1顯著抑制RA-FLS細胞增殖和促炎細胞因子的釋放，并且促進其凋亡，見表6。此外，TRIB1過表達后，TNF-α對Bcl-2、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平的促進作用以及對Bax水平的抑制作用幾乎受到抑制，見表7。

3.4 ICA以依賴于TRIB1的方式對NF-κB通路激活的抑制作用 TRIB1是炎癥信號通路的關鍵上游調節因子。首先，Western blot和qRT-PCR檢測顯示，TNF-α處理使TRIB1表達受到抑制，ICA治療后表達增加，轉染siTRIB1逆轉了ICA對TNF-α處理的RA-FLS中TRIB1表達的促進作用，見表8、表9。同時發現，TNF-α處理后RA-FLS中p-p65和p-IκB蛋白水平顯著上調，ICA顯著降低p-p65和p-IκB蛋白水平，但與siTRIB1聯合治療時，ICA的抑制作用消失，見表8。

4 討 論

RA是一種以滑膜炎為特征的慢性炎癥性疾病，滑膜炎會導致關節軟骨和骨破壞［16］。正常情況下，FLS是滑膜組織的核心組成，維持膝關節的動態穩定及結構完整性［17］。然而在RA中，免疫微環境改變導致FLS具有過度增殖和惡性侵襲等生物學特征，表達參與軟骨和非骨支持結構破壞相關的基質金屬蛋白酶，促進破骨分化和抑制骨修復引起骨侵蝕［18-19］。因此，靶向RA-FLS是一種很有前途的RA治療策略。

淫羊藿辛、甘、溫，具有祛風濕、補腎陽、強筋骨功效，深得扶陽派醫者喜愛。認為淫羊藿能夠引陽入陰，且在溫補陽氣的同時又能使陰平陽秘［20］。對于痹證日久累及肝腎等臟腑者，常與附子、威靈仙、杜仲等配伍使用［21］。ICA為從淫羊藿中提取出來的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、延緩衰老、抗骨質疏松、改善心肌缺血缺氧、平衡免疫功能、增強生殖內分泌性能等多種藥理功效［22］。

前期研究發現，ICA可通過作用于miR-223-3p緩解RA［23］。最近有學者研究也表明，ICA抑制FLS的增殖、遷移和細胞因子分泌［24］，但其機制尚不明確。本研究發現，ICA抑制RA-FLS增殖，且促進其凋亡。IL-1β、IL-6和IL-8作為一種重要的細胞因子被證實對RA的發展至關重要［25］。本研究結果顯示，在RA-FLS中，抗凋亡蛋白Bcl-2及炎性細胞因子IL-1β、IL-6和IL-8被ICA抑制，促凋亡蛋白Bax升高，表明ICA可能通過作用于RA-FLS緩解RA。

TRIB蛋白在癌癥和免疫調節中發揮重要作用。TRIB1是先天免疫的重要中介，是TRIB家族的重要成員。在RA中，TRIB1也通過調控基因表達和信號通路發揮抗炎作用［10］，但TRIB1如何參與ICA對RA的調控尚不清楚。本研究發現，在TNF-α處理的RA-FLS中TRIB1表達顯著降低，而ICA處理后顯著上調。過表達TRIB1時，RA-FLS凋亡增加，增殖減少，炎性細胞因子IL-1β、IL-6和IL-8分泌及蛋白表達減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax表達增加。此外，敲除TIRB1可以逆轉ICA對TNF-α處理的RA-FLS細胞的抑制作用，表明TRIB1過表達在TNF-α處理的RA-FLS中發揮保護作用，提示TRIB1可能是ICA在TNF-α介導的RA-FLS中的功能靶點。

在RA中，NF-κB激酶抑制劑磷酸化促進IκBα的降解，并導致NF-κB的釋放，釋放的NF-κB促進下游靶點的轉錄，包括IL-1β、IL-6和IL-8，導致RA進展［26］。本研究結果顯示，TNF-α處理使TRIB1表達受到抑制，ICA處理后表達增加，敲降TRIB1逆轉了ICA對TRIB1表達的促進作用。TNF-α處理后，RA-FLS中p-p65和p-IκB蛋白水平顯著上調，但ICA顯著降低p-p65和p-IκB蛋白水平。在TRIB1基因敲除后，ICA對RA-FLS中p-p65和p-IκB蛋白水平的抑制作用顯著降低。因此，ICA通過上調TRIB1表達抑制NF-κB。

綜上所述，本研究從細胞水平首次證實ICA通過上調TRIB1抑制NF-κB信號促下游炎性細胞因子的釋放，從而抑制RA-FLS炎癥，具有重要臨床意義。然而，目前國內外對于ICA抵抗RA的研究尚不足，以單靶點、單一信號通路為主。如雷杰等［27］通過NLRP3炎性小體信號通路研究ICA對RA小鼠的干預作用。針對多信號通路等研究尚缺乏。因此，需進一步從細胞水平、動物水平、臨床水平開展代謝組學、轉錄組學、蛋白組學等多層次、多靶點、多通路的全方位研究，全面闡明ICA抗RA的效應機制，為開發用于抗RA提供有力的循證醫學證據，促進我國中醫藥產業的發展。

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收稿日期：2023-02-01；修回日期：2023-03-19