復方葶藶子湯治療慢性肺源性心臟病的作用機制研究*

林婷婷，王慧，張真，伍新誠，管聘，柏正平

1 湖南中醫(yī)藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 湖南長沙 410006

慢性肺源性心臟病（chronic pulmonary heart disease；CPHD）是由于呼吸系統(tǒng)疾病（包括支氣管-肺組織、胸廓或肺血管病變）導致右心室結構和/或功能改變的疾病，其多繼發(fā)于慢性阻塞性肺疾病，病程久，易反復發(fā)生，預后不佳，病死率高，給社會帶來了沉重的負擔。肺心病屬于中醫(yī)“肺脹、喘證、水腫”等范疇，《丹溪心法·咳嗽》曰：“肺脹而嗽，或左或右不得眠，此痰夾瘀血礙氣而病”。肺心病發(fā)病的關鍵在于“濕勝陽虛”[1]，發(fā)病因素早期以痰飲內(nèi)伏為主，日久痰瘀并重，基于此理論基礎并結合長期臨床診療經(jīng)驗，湖南省名中醫(yī)柏正平教授創(chuàng)立出治療CPHD的有效經(jīng)驗方——復方葶藶子湯，該經(jīng)驗方的治療指導思想為“飲瘀同治”，該方制成的復方葶藶子膠囊已完成前期臨床研究[2]，臨床研究表明復方葶藶子膠囊對肺心病合并心衰有較好的療效，其作用機制可能是通過加強心肌收縮力，降低動脈血CO2分壓、改善肺通氣換氣功能、降低血液黏稠度，從而改善肺部血液循環(huán)，減輕心臟前負荷來改善心功能，但在完成臨床療效觀察的基礎上，該方潛在的藥效物質基礎尚不清楚，且藥物的作用靶點、生物途徑及作用機制也未闡明。故本文基于網(wǎng)絡藥理學研究復方葶藶子湯治療慢性肺源性心臟病的作用機制。

資料與方法

1 “復方葶藶子湯”化學成分及成分靶點的收集和篩選

復方葶藶子湯藥物主要由葶藶子、黃芩、桂枝、茯苓、白術、矮地茶、水蛭、地龍這幾味藥物組成。利用 TCMSP（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，搜索出藥物的全部活性成分，參照藥代動力學的吸收、分布、代謝和排泄（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME）特性，以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，篩選出復方葶藶子湯藥物的有效化學成分；由于在TCMSP數(shù)據(jù)庫中未找到水蛭、地龍這倆味藥的有效成分，通過文獻檢索，補充在TCMSP上未檢索到的水蛭、地龍兩味蟲類藥的有效成分，通過化源網(wǎng)找到這兩味藥的CAS號，在pubchem上找到他們的2d結構化學式，先通過SwissADME 數(shù)據(jù)庫平臺（http：// www.swissadme.ch/），以胃腸道利用度（GI absorption，GA）為“High”、類藥性（Druglikeness，DL）所包含（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中2項及2項以上為“Yes”篩選條件，篩選出符合的活性成分，然后將其2D Structure導入到 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）檢索獲得水蛭、地龍成分靶點。最終建立藥物有效成分-靶點數(shù)據(jù)庫。

2 慢性肺源性心臟病疾病靶點篩選+交集靶點

在生物信息綜合數(shù)據(jù)庫Genecards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中，以“chronic pulmonary heart disease”作為關鍵詞進行檢索，獲得數(shù)據(jù)庫中信度較高（score≥20）的慢性肺源性心臟病相關靶點，刪除重復值后建立慢性肺源性心臟病相關靶點。利用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線繪圖工具獲取交集靶點，繪制韋恩圖。

3 構建PPI網(wǎng)絡圖和“藥物-有效成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

將交集靶點導入string11.5（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapines”進行檢索，以score≥0.9為篩選條件，獲取蛋白質-蛋白質（PPI）互相作用網(wǎng)絡圖。將獲取的靶點PPI信息圖導入cytoscape3.9.1軟件繪制“方藥-有效成分-交集靶點-疾病圖”。

4 GO分析與KEGG通路富集分析，并繪制氣泡圖

將交集靶點基因信息投射到Metascape（https：//metascape.org）數(shù)據(jù)庫，選擇物種 H.sapiens，設置P-value＜0.01 為基因富集臨界值，分別進行GO 分子功能（Molecular Functions，MF）、GO 生物過程（Biological Processes，BP）、GO 細胞組成（Cellular Components，CC）、KEGG通路富集分析，獲得數(shù)據(jù)，并通過微生信在線工具（www.bioinformatics.com.cn）將結果分別進行氣泡圖及柱狀圖繪制。

結 果

1 “復方葶藶子湯”活性成分的篩選

篩選出復方葶藶子湯各中藥化學成分 114 個；對復方葶藶子湯各成分作用靶點進行匯總，刪除重復值得到靶點599個。見表1。

2 慢性肺源性心臟病的潛在作用靶點預測及“方藥-有效成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡圖構建

在Genecards中搜索“chronic pulmonary heart disease”為關鍵詞，取relevance score為＞20，篩選疾病靶點，得到慢性肺源性心臟病靶點為1667個。使用 Venny 2.1在線平臺繪制“復方葶藶子湯-慢性肺源性心臟病”交集靶點韋恩圖，得到246個共同靶點，見圖2。并建立“方藥-疾病-交集靶點-疾病”數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)庫文件導入cytoscape軟件構建，見圖3。

圖2 復方葶藶子湯-慢性肺源性心臟病”交集靶點韋恩

圖3 方藥-有效成分-交集靶點-疾病

3 “ 復方葶藶子湯”與“慢性肺源性心臟病”靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡（ PPI）的構建

將“藥物成分-疾病靶點”數(shù)據(jù)庫文件中的靶點信息導入 STRING11.5網(wǎng)站，并利用cytoscape軟件構建 PPI，圖中共包含節(jié)點245個，邊1310條，平均節(jié)點度10.7，根據(jù)靶點蛋白之間相互作用的平均度值篩選出核心靶點。靶蛋白按度值由高至低依次為：SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、AKT1、HSP90AA1、PIK3CA、TP53、RELA、JUN、EGFR、MAPK14、PTPN11、CREBBP、MAPK8、ESR1、IL6、RHOA、TNF。平均degree值為31。見圖4。

圖4 “復方葶藶子湯”與慢性肺源性心臟病的PPI網(wǎng)絡

4 GO分析及KEGG通路分析

將246個交集靶點輸入Metascape軟件中，進行GO生物過程分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。

GO分析注釋結果分析：生物過程 20 個，細胞組成20個，分子功能 20個，生物過程（Biological Process，BP）說明復方葶藶子湯治療慢性肺源性心臟病與激素反應（response to hormone）、激酶活性的調(diào)節(jié)（regulation of kinase activity）、蛋白質磷酸化的正向調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）、細胞對氮化合物的反應（cellular response to nitrogen compound）、對外來刺激的反應（response to xenobiotic stimulus）、對細菌起源的分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、細胞對脂質的反應（cellular response to lipid）、細胞黏附的調(diào)控（regulation of cell adhesion）有關。細胞組成（Cellular Component，CC）涉及膜微結構域（membrane microdomain）、質膜筏（plasma membrane raft）、胞質囊腔（cytoplasmic vesicle lumen）、分泌顆粒內(nèi)腔（secretory granule lumen）、ficolin-1-rich顆粒（ficolin-1-rich granule）、質膜蛋白復合物（plasma membrane protein complex）、黏著斑（focal adhesion）、細胞基質結（cell-substrate junction）、初級溶酶體（primary lysosome）等。分子功能（Molecular Functions MF）包括蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、生長因子結合（growth factor binding）、血管內(nèi)皮生長因子受體活性（vascular endothelial growth factor receptor activity）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）、肽鏈內(nèi)切酶活性（endopeptidase activity）等分子活性調(diào)節(jié)。見圖5。

圖5 GO分析

KEGG信號通路富集分析：篩選得到的前20條信號富集通路，分別是脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、c型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、細胞凋亡（Apoptosis）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、toll樣受體信號通路（Tolllike receptor signaling pathway）等通路。見圖6。

圖6 KEGG富集分析

討 論

慢性肺源性心臟病（chronic pulmonary heart disease）是由于呼吸系統(tǒng)疾病（包括支氣管-肺組織、胸廓或肺血管病變）導致右心室結構和/或功能改變的疾病，肺血管阻力增加和肺動脈高壓是其中的關鍵環(huán)節(jié)，且其多繼發(fā)于慢性阻塞性肺疾病[3]，病程久，易反復發(fā)生，預后不佳，病死率高，給社會帶來了沉重的負擔。肺心病屬于中醫(yī)“肺脹、喘證、水腫”等范疇，標，《諸病源候論·咳逆短氣候》所云：“肺虛為微寒所傷則咳嗽，嗽則氣還于肺間則肺脹……”肺心病以陽虛為本，兼夾痰飲淤血，壅滯肺氣，使得肺氣脹滿不能斂降，而纏綿難愈的根本原因在于“痰飲內(nèi)伏”，痰飲為濕所化，脾主灌四傍，若脾陽不足以化濕，濕不去，反之耗傷陽氣，使陽氣愈虛，氣不化濕，上聚成痰飲誘發(fā)咳喘。《丹溪心法·咳嗽》日：“肺脹而嗽，或左或右不得眠，此痰夾瘀血礙氣而病”。飲為陰邪，得溫則化，肺氣壅滯，無法調(diào)暢全身氣機，心主血脈，肺虛無法助心行血，導致淤血內(nèi)阻。故治療上當從痰飲論治[4]，痰飲的治療在《金匱要略》中已經(jīng)明確提出當以溫藥和之，脾為生痰之源，脾陽虛愈會加重痰濕，多以利小便使?jié)裥坝型穪磉_到通陽的目的。通陽化濕的同時兼以活血祛瘀，結合仲景最早提出的“血不利則為水”理論[5]，“血不利”血不利代表的是血液運行受阻、血行不暢、血液淤積予血脈或是臟器之內(nèi)的各種淤血狀態(tài)，瘀血阻滯脈絡，血不循經(jīng)，津液溢出脈外，水液潴留，便形成水腫。復方葶藶子湯由葶藶大棗瀉肺湯和苓桂術甘湯加減化裁而成，痰飲上壅胸膈，直阻肺氣，不令下降，呼息難通，非用急法不可。葶藶子，味苦、辛、性寒，入足太陽膀胱經(jīng)，能破氣滯而定喘，瀉停水而寧嗽，其苦寒迅利，行氣瀉水，決壅塞而排痰飲，破凝瘀而通經(jīng)脈，凡停痰宿水、嗽喘腫脹之病，甚奏奇功，《醫(yī)宗金鑒》中載道：“治肺癰不得臥，及水飲攻肺喘急者”；黃芩清熱化痰，止咳平喘，宣肺降氣平喘；苓桂術甘湯方出自張仲景的《傷寒雜病論》，是“病痰飲者，當以溫藥和之”的代表方劑，《絳雪園古方選注》道：此太陽、太陰方也。膀胱氣鈍則水蓄，脾不行津液則飲聚。白術、甘草和脾以運津液，茯苓、桂枝利膀胱以布氣化。崇土之法，非但治水寒上逆，并治飲邪留結，頭身振搖，重用茯苓，其甘淡性平，歸脾，膀胱，心肺諸經(jīng)，甘能補脾，淡能滲濕，能使水飲從小便而出；濕淫所勝，小便不利，淡味滲邪，陽也。治水緩脾，生津導氣，桂枝辛甘溫，有助通心陽和溫通經(jīng)脈的作用，為溫陽化氣以行水，下氣降逆之要藥。茯苓甘淡利水，行肺之治節(jié)，養(yǎng)心安神，補土制水；桂枝即可溫陽化氣，又可平?jīng)_降逆，苓、桂相伍，溫利并用，共奏溫陽化飲之效。飲之生成與脾陽不足密切相關，故用苦溫而燥的白術，振奮脾陽，運脾燥濕，脾陽振奮，又可助肺陽之輸布，腎陽之溫化，心陽之溫煦，則痰飲無所停留；矮地茶，性平，味苦，辛、歸肺、肝經(jīng)，結合現(xiàn)代藥理研究[6]，矮地茶可減少試驗性氣管炎杯狀細胞的增生程度，使痰液減少，并可加速炎癥細胞浸潤的恢復，從而改善肺氣腫；活血化瘀法應貫穿治療始終，蟲類藥其性搜剔，可入里入絡改善絡脈循環(huán)，促使痰化飲消；功善走竄，直達病所，宣暢絡脈氣機，祛除絡脈中的血瘀，其療效非草木植物藥可比。正同《醫(yī)學衷中參西錄》中道：“其走竄之性無微不至，故能宣通臟腑、貫徹經(jīng)絡、透達關竅，凡血凝、血聚為病皆能開之。”水蛭活血化瘀，可助肺宣暢氣機，地龍通絡平喘兼利尿，使藥效直達病所，“飲瘀同治”之法，飲去則痰無以生，瘀去則絡得通暢，同時已有實驗證實復方葶藶子湯多方面、多靶點減輕肺小動脈痙攣、擴張肺血管，降低肺動脈壓力從而改善癥狀[7]。

本研究從復方葶藶子湯中中篩選出槲皮素（quercetin）、鳥嘌呤（Guanine）、水蛭素A（Hirudinoidine A）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、木蝴蝶素a（oroxylin a）有效成分，其中槲皮素屬于黃酮類化合物，藥理特性寬泛[8]。研究表明，氧化應激可直接引起肺組織損傷，促進肺部炎癥反應，進一步加重蛋白酶-抗蛋白酶失衡及氣道黏液高分泌。槲皮素具有良好的抗氧化活性，可以直接清除氧化應激產(chǎn)生活性氧（ROS），保護生物被膜，提高清除ROS的酶活性，同時螯合金屬離子Fe、Cu等抑制ROS產(chǎn)生。同時槲皮素能使炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9等顯著降低，從而減輕肺部炎癥細胞浸潤，并通過抑制p50、p65、ERK1/2和JBK1/2等磷酸化，抑制NF-κB和MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用，降低氧化應激刺激對肺部損傷[9-10]。

PPT網(wǎng)絡結果分析提示SRC、AKT1、HSP90AA1、PIK3CA、EGFR、MAPK14、PTPN11、CREBBP、MA為復方葶藶子湯治療慢性肺源性心臟病的核心靶點，SRC激酶[11]是具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白質，其在細胞增殖、分化等細胞進程中發(fā)揮重要作用，SRC的活化參與各種氣道炎癥反應的誘導機制，包括活化EGFR誘導STAT3信號轉導，增加細胞因子和趨化因子的表達，激活p38 MAPK和NF-kB通路等。研究表明[12]抑制SRC活化可以抑制MMP-9和MMP-12的誘導以及肺內(nèi)CTSK、IL-17、TNF-α、MCP-1和KC的表達，從而抑制氣道炎癥和肺組織破壞。

通過 KEGG 富集分析得到分別是脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、c型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、細胞凋亡（Apoptosis）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等通路，TNF是一種參與全身炎癥的細胞信號蛋白，有多種下游傳導途徑，通過激活NF-κB、c-Jun、MAPK通路及Caspase酶聯(lián)級反應等引起各種經(jīng)典促炎細胞因子的表達、誘導細胞凋亡。有研究表明[13]，降低TNF-α水平能有效減輕氣道炎癥反應，抑制黏液高分泌，改善患者氣流受限程度。IL-17主要由Th17細胞分化，是其主要的效應細胞，在早期炎癥反應中，可進一步促進TNF-α、IFN-α等炎癥因子分泌，加劇炎癥反應，誘導細胞凋亡，推動疾病進展[14]。綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學探索復方葶藶子湯治療慢性肺源性心臟病的主要成分、作用靶點及信號通路，從分子機制角度證實了復方葶藶子湯治療慢性肺源性心臟病的有效性。