GRHL2與MLH1的表達與非小細胞肺癌臨床特征的相關性研究

張 杰

天津市濱海新區(qū)大港中醫(yī)醫(yī)院呼吸內科 (天津 300270)

肺癌是源于支氣管粘膜上皮、支氣管腺體、肺泡的惡性腫瘤。數據顯示，全球新發(fā)癌癥發(fā)病率(11.6%)及死亡率(18.4%)最高的癌癥為肺癌[1-2]。非小細胞肺癌(non-smaall cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的一種，占所有肺癌的80%以上；主要包括腺癌、鱗癌(鱗狀細胞癌)、大細胞癌[3]。研究顯示，NSCLC的癌細胞生長較慢，發(fā)生擴散轉移時間與小細胞肺癌相比較晚[4]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，基因起到了至關重要的作用。粒狀頭樣2(grainyhead like 2，GRHL2)基因是GRHL家族成員之一，在21世紀初被發(fā)現，后被認為是新的轉錄因子，參與了細胞分化、胚胎發(fā)育、表皮損傷修復等過程。大量研究顯示，GRHL2的異常表達與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，在乳腺癌、肝癌、鱗狀細胞癌患者的組織中有GRHL2的異常表達[5]。Mutl homolog 1(MLH1)基因，是一種錯配修復蛋白，可通過矯正錯配變異的DNA 恢復基因的正常功能而發(fā)揮抑癌基因的作用，研究發(fā)現MLH1 基因的變異或異常甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[6]。本研究分析了GRHL2與MLH1的表達與NSCLC臨床特征的相關性研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2016年1月至2021年4月，在天津市濱海新區(qū)大港中醫(yī)醫(yī)院接受治療并經過手術確診的486例NSCLC患者，其中腺癌105例、鱗癌310、大細胞癌71例，男309例，女177例；患者年齡為27～83歲，平均年齡為(57.39±7.41)歲。臨床分期為Ⅰ期101例，Ⅱ～Ⅲ例385期，所有患者均行手術治療前未接受任何藥物治療或輔助治療，手術中癌組織切除后，立即采集標本進行保存?zhèn)渥ⅰＥ懦v資料不全者、失訪者，合并嚴重疾病患者，手術治療前接受化療、免疫治療、靶向治療等患者。

1.2 方法GRHL2基因表達檢測：將術后保存的樣本，通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測GRHL2的表達。采用Trizol法提取NSCLC樣本中RNA，使用逆轉錄試劑盒，逆轉錄為cDNA；通過qRT-PCR法檢測GRHL2的表達情況。在所有標本中，采用Western 印跡法檢測NSCLC和癌旁組織中GRHL2蛋白表達情況，Western blot法參照全應軍等[9]在結直腸癌中檢測GRHL2表達。

MLH1甲基化檢測：采用甲基化特異性PCR( MSP)法，從保存的樣本組織中提取 DNA，采用 Intergen 公司的 CPGenome TMDNA Modification Kit 對 DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，已修飾的DNA作為模板，利用甲基化和非甲基化特異性引物進行PCR擴增MLH1甲基化和非甲基化的PCR擴增條件為(95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃30s)，循環(huán)42次，最后延伸 72℃5min。之后利用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.3 觀察指標整理患者臨床資料，統計整理患者GRHL2的表達情況、MLH1甲基化情況，按照臨床特征分類，分析GRHL2的表達、MLH1甲基化與臨床特征的相關性。

1.4 統計分析應用 SPSS22.0統計軟件進行數據統計分析。計數資料用[n(%)]表示，組間比較用χ2檢驗；GRHL2、MLH1的表達情況與臨床特征的相關性分析，采用Spearman相關分析；生存分析采用生存分析。

2 結 果

2.1 患者臨床特征486例NSCLC患者，在年齡＞40、腫瘤大小＞3cm、臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、淋巴結發(fā)生轉移、組織類型為鱗癌的患者較多，且差異較為明顯(P＜0.05)。

表1 患者臨床特征

GRHL2在癌組織中379例呈現高表達，107例低表達，而在癌旁組織中187例呈現高表達，299例呈現低表達，GRHL2在癌組織中呈現高表達趨勢，在癌旁組織中，呈低表達趨勢；GRHL2在癌組織與癌旁組織的表達具有明顯差異(P＜0.05)。

表2 GRHL2的表達情況

在NSCLC中MLH1基因甲基化占比為46.84%，其中部分甲基化為34.29%；完全甲基化為12.55%。在癌旁組織中甲基化占比為24.61%，其中部分甲基化為5.52%；完全甲基化為19.09%。NSCLC中MLH1基因甲基化程度明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。

表3 NSCLC患者MLH1甲基化情況?

Spearman分析顯示，GRHL2的表達與腫瘤大小，臨床分期，淋巴結轉移均存在顯著相關性(P＜0.01)，與組織類型明顯相關(P＜0.05)，但與年齡，性別無明顯相關性(P＞0.05)。

表4 NSCLC患者GRL2與臨床特征相關性分析

表4 NSCLC患者GRL2與臨床特征相關性分析

臨床參數 分類 n GRHL2 χ2 P r低表達 高表達(n=107) (n=379)年齡(歲) ≤40 91 25 66 1.941 0.164 0.063＞40 395 82 313性別 男 309 64 245 0.841 0.359 0.042女 177 43 134腫瘤大小(cm) ≤3 114 48 66 35.007 0.000 0.268＞3 372 59 313臨床分期 Ⅰ期 101 42 59 28.433 0.000 0.242Ⅱ～Ⅲ期 385 65 320淋巴結轉移 否 193 67 126 30.067 0.000 0.249是 293 40 253組織類型 鱗癌 310 79 231 5.994 0.014 0.111腺癌或其他 176 28 148

2.5 GRHL2表達和MLH1甲基化與患者預后相關性MLH1甲基化、GRHL2高表達與NSCLC患者生存時間呈負相關(P＜0.01)。

表5 GRHL2表達和MLH1甲基化與患者預后相關性

3 討 論

hMLH1基因位于3號染色體p21區(qū)。是人體重要的DNA錯配修復蛋白基因，該基因的突變或甲基化異常，可引起細胞錯配修復功能缺陷，導致腫瘤的發(fā)生。DNA錯配修復基因一類腫瘤相關基因，其非癌基因，也非抑癌基因，但在腫瘤發(fā)病的分子機制方面起到重要作用。主要包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。hMLH1基因的異常甲基化可引起微衛(wèi)星DNA，影響錯配修復蛋白相互配合完成 DNA損傷的修復過程[7]。本研究結果顯示，NSCLC中MLH1基因甲基化占比為46.84%，癌旁組織中甲基化占比為24.61%，NSCLC中MLH1基因甲基化程度明顯高于癌旁組織。表明MLH1基因甲基化異常，與癌細胞惡性轉化和腫瘤進展相關，另外，經過Spearman相關性分析發(fā)現MLH1甲基化與患者生存時間呈現明顯負相關。這一結論，與王延寧等人在NSCLC的相關研究中結果相似。

經整理分析發(fā)現486例NSCLC患者中，年齡＞40歲，男性患者較多，這與國家癌癥中心最新發(fā)布的2019年癌癥數據報告內容一致，其中男性腫瘤發(fā)病率位居的首位為肺癌，其高發(fā)年齡段為55歲以上。另外，本研究中腫瘤大小＞3cm、臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、淋巴結發(fā)生轉移、組織類型為鱗癌的患者較多，這與目前醫(yī)療技術水平和人們健康意識相關。往往肺癌在發(fā)現確診時均處于中晚期，不利于患者治療及預后，這也是我國肺癌生存率較低的主要原因[8]。

GRHL2基因可以促進細胞增殖，誘導細胞凋亡，其異常表達也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9]。本研究發(fā)現，GRHL2在NSCLC組織中呈現高表達趨勢，在癌旁組織中，呈低表達趨勢；并具有明顯差異(P＜0.01)。經過相關性分析發(fā)現，GRHL2的表達與腫瘤大小，臨床分期，淋巴結轉移均存在顯著相關(P＜0.01)，與組織類型明顯相關(P＜0.05)。表明GRHL2基因可能參與NSCLC的發(fā)展過程，同時，GRHL2基因在鱗癌中存在高表達狀態(tài)，可能與其生理功能相關。我們還發(fā)現，MLH1甲基化、GRHL2高表達與NSCLC患者生存時間呈負相關，同時大量臨床數據顯示GRHL2基因的高表達與乳腺癌患者的無復發(fā)的生存時間負性相關，并且可以增加患者的轉移風險[10]，這一結論與本研究結論一致。

綜上所述，MLH1甲基化、GRHL2差異表達與NSCLC患者腫瘤大小，臨床分期，淋巴結轉移情況密切相關，同時與患者生存時間呈負相關，在NSCLC的治療過程中具有重要的參考價值。